RESUMO
In samples of harmful algal blooms (HABs), seawater can contain a high abundance of microorganisms and elemental ions. Along with the hardness of the walls of key HAB dinoflagellates such as Prorocentrum triestinum, this makes RNA extraction very difficult. These components interfere with RNA isolation, causing its degradation, in addition to the complex seawater properties of HABs that could hinder RNA isolation for effective RNA sequencing and transcriptome profiling. In this study, an RNA isolation technique was established through the modification of the Trizol method by applying the Micropestle System on cell pellets of P. triestinum frozen at -20 °C, obtained from 400 mL of culture with a total of 107 cells/mL. The results of the modified Trizol protocol generated quality RNA samples for transcriptomics sequencing, as determined by their measurement in Analyzer Agilent 4150.
Assuntos
Dinoflagellida , Dinoflagellida/genética , RNA/isolamento & purificação , RNA/genética , Guanidinas/química , Análise de Sequência de RNA/métodos , Proliferação Nociva de Algas , Perfilação da Expressão Gênica/métodos , Transcriptoma , Nucleotídeos/genética , Nucleotídeos/isolamento & purificação , Água do Mar , FenóisRESUMO
The golden mussel, Limnoperna fortunei, is a mollusk native to Southeast Asia and a highly invasive species in South American countries such as Brazil, Uruguay, and Argentina. In order to better understand the biological behavior of the species and develop alternative control methods, genetic studies involving the optimization of DNA isolation procedures are of utmost importance.The objective of the present study was to develop a simple, reproducible, free of contaminants, and cheap protocol to extract DNA from L. fortunei using the adductor muscle of the mussel as the source. Four DNA extraction protocols were compared: extraction with SDS and proteinase K (P1); extraction with SDS, proteinase K and phenol (P2); TRIzol extraction (P3); and NaCl, SDS and RNase extraction (P4). DNA concentration (ng μL-1) and purity (at 260/280 nm) were measured using a spectrophotometer. DNA purity and amplification were verified by electrophoresis and PCR, respectively. P1 resulted in samples with low DNA concentrations or without any DNA, as revealed by the quantification and purity analysis; P2 had low efficiency, given the absence of DNA in most of the samples subjected to electrophoresis. On the other hand, P3 showed contamination with proteins, as indicated by an absorbance of <1.8 and by the low-quality electrophoresis results. Finally, P4 resulted in well-defined bands, absorbance between 1.8 and 2.0, and successful amplification by PCR. In conclusion, the extraction protocol P4 is a practical, fast, free of contaminants, and efficient method for the isolation of L. fortunei DNA.
O mexilhão dourado, Limnoperna fortunei é um molusco originário do sudeste da Ásia, altamente invasor em países Sul-Americanos como Brasil, Uruguai e Argentina. Para compreender melhor o comportamento biológico da espécie e criar alternativas de controle é indispensável a realização de estudos genéticos, onde a otimização dos procedimentos de isolamento do DNA é fundamental.O objetivo desse estudo foi obter um protocolo simples, reproduzível, não contaminante e barato para a extração do DNA de L. fortunei. Foram comparados quatro protocolos experimentais de extração de DNA, utilizando como material biológico o músculo abdutor: extração por SDS e proteinase K (P1), extração por SDS, proteinase K e fenol (P2), extração por Trizol (P3) e extração por NaCl (P4). A quantificação (ng μL-1) e a pureza (260/280 nm) do DNA foram obtidas por espectrofotometria. A integridade e a amplificação do DNA foram verificadas através de eletroforese e PCR, respectivamente. P1 demonstrou baixas concentrações e ausência de DNA nas amostras, identificado pela quantificação e teste de integridade. P2 apresentou baixa eficácia, visualizada pela ausência de DNA na maioria das amostras na eletroforese. Por outro lado, P3 exibiu sinais de contaminação por proteínas, identificado pela razão de absorbância <1.8 e pela baixa qualidade da eletroforese. Finalmente, P4 mostrou um padrão na formação das bandas, absorbância entre 1,8 2,0 e sucesso na amplificação pela PCR. Conclui-se que o protocolo de extração P4 mostrou-se como um método prático, rápido, não contaminante e eficiente para obtenção do DNA de L. fortunei.
Assuntos
Animais , DNA , Bioacumulação/legislação & jurisprudência , Perna (Organismo)/genética , Dodecilsulfato de Sódio , Endopeptidase K/administração & dosagem , Reação em Cadeia da Polimerase/veterinária , Ribonucleases/administração & dosagemRESUMO
The golden mussel, Limnoperna fortunei, is a mollusk native to Southeast Asia and a highly invasive species in South American countries such as Brazil, Uruguay, and Argentina. In order to better understand the biological behavior of the species and develop alternative control methods, genetic studies involving the optimization of DNA isolation procedures are of utmost importance.The objective of the present study was to develop a simple, reproducible, free of contaminants, and cheap protocol to extract DNA from L. fortunei using the adductor muscle of the mussel as the source. Four DNA extraction protocols were compared: extraction with SDS and proteinase K (P1); extraction with SDS, proteinase K and phenol (P2); TRIzol extraction (P3); and NaCl, SDS and RNase extraction (P4). DNA concentration (ng μL-1) and purity (at 260/280 nm) were measured using a spectrophotometer. DNA purity and amplification were verified by electrophoresis and PCR, respectively. P1 resulted in samples with low DNA concentrations or without any DNA, as revealed by the quantification and purity analysis; P2 had low efficiency, given the absence of DNA in most of the samples subjected to electrophoresis. On the other hand, P3 showed contamination with proteins, as indicated by an absorbance of <1.8 and by the low-quality electrophoresis results. Finally, P4 resulted in well-defined bands, absorbance between 1.8 and 2.0, and successful amplification by PCR. In conclusion, the extraction protocol P4 is a practical, fast, free of contaminants, and efficient method for the isolation of L. fortunei DNA.(AU)
O mexilhão dourado, Limnoperna fortunei é um molusco originário do sudeste da Ásia, altamente invasor em países Sul-Americanos como Brasil, Uruguai e Argentina. Para compreender melhor o comportamento biológico da espécie e criar alternativas de controle é indispensável a realização de estudos genéticos, onde a otimização dos procedimentos de isolamento do DNA é fundamental.O objetivo desse estudo foi obter um protocolo simples, reproduzível, não contaminante e barato para a extração do DNA de L. fortunei. Foram comparados quatro protocolos experimentais de extração de DNA, utilizando como material biológico o músculo abdutor: extração por SDS e proteinase K (P1), extração por SDS, proteinase K e fenol (P2), extração por Trizol (P3) e extração por NaCl (P4). A quantificação (ng μL-1) e a pureza (260/280 nm) do DNA foram obtidas por espectrofotometria. A integridade e a amplificação do DNA foram verificadas através de eletroforese e PCR, respectivamente. P1 demonstrou baixas concentrações e ausência de DNA nas amostras, identificado pela quantificação e teste de integridade. P2 apresentou baixa eficácia, visualizada pela ausência de DNA na maioria das amostras na eletroforese. Por outro lado, P3 exibiu sinais de contaminação por proteínas, identificado pela razão de absorbância <1.8 e pela baixa qualidade da eletroforese. Finalmente, P4 mostrou um padrão na formação das bandas, absorbância entre 1,8 2,0 e sucesso na amplificação pela PCR. Conclui-se que o protocolo de extração P4 mostrou-se como um método prático, rápido, não contaminante e eficiente para obtenção do DNA de L. fortunei.(AU)
Assuntos
Animais , Perna (Organismo)/genética , DNA/isolamento & purificação , DNA/síntese química , Bioacumulação/legislação & jurisprudência , Reação em Cadeia da Polimerase/veterinária , Dodecilsulfato de Sódio , Ribonucleases/administração & dosagem , Endopeptidase K/administração & dosagemRESUMO
A suitable technique (lysozyme combined with Trizol reagent) was developed to improve the RNA yield, purity and integrity from Bacillus subtilis, under different bacterial growth stages. The obtained RNA was intact, having the required characteristics for downstream applications.
Assuntos
Bacillus subtilis/efeitos dos fármacos , Guanidinas/farmacologia , Biologia Molecular/métodos , Muramidase/farmacologia , Fenóis/farmacologia , RNA Bacteriano/isolamento & purificação , Bacillus subtilis/genética , Bacillus subtilis/crescimento & desenvolvimento , Combinação de Medicamentos , Técnicas GenéticasRESUMO
Polysaccharides are substances that modify the biological response to several stressors. The present study investigated the antitumor activity of the soluble fraction of polysaccharides (SFP), extracted from cabernet franc red wine, in Walker-256 tumor-bearing rats. The monosaccharide composition had a complex mixture, suggesting the presence of arabinoglactans, mannans, and pectins. Treatment with SFP (30 and 60mg/kg, oral) for 14days significantly reduced the tumor weight and volume compared with controls. Treatment with 60mg/kg SFP reduced blood monocytes and neutrophils, reduced the tumor activity of N-acetylglucosaminidase, myeloperoxidase, and nitric oxide, increased blood lymphocytes, and increased the levels of tumor necrosis factor α (TNF-α) in tumor tissue. Treatment with SFP also induced the expression of the cell necroptosis-related genes Rip1 and Rip3. The antineoplastic effect of SFP appears to be attributable to its action on the immune system by controlling the tumor microenvironment and stimulating TNF-α production, which may trigger the necroptosis pathway.
Assuntos
Antineoplásicos/farmacologia , Apoptose , Neoplasias Experimentais/tratamento farmacológico , Polissacarídeos/farmacologia , Vinho , Animais , Antineoplásicos/química , Polissacarídeos/química , Proteínas Serina-Treonina Quinases/metabolismo , Ratos , Proteína Serina-Treonina Quinases de Interação com Receptores/metabolismo , Fator de Necrose Tumoral alfa/metabolismoRESUMO
Potato yellow vein virus (PYVV, Crinivirus/Closteroviridae), contiene genoma tripartita de ssRNA(+), se limita al floema y causa pérdidas en la producción. Es un virus re-emergente y cuarentenario en Europa y Estados Unidos. La detección se ha basado en RT-PCR, NASH y RT-PCR en tiempo real (RT-qPCR) en muestras de foliolo y tubérculo. Se desconoce como es la distribución del virus en plantas infectadas lo que hace necesario establecer un método de extracción de RNA, que sea eficiente en la obtención de material a partir de diferentes órganos. El objetivo de este trabajo fue comparar tres métodos de extracción de RNA: uno basado en Tioisocianato de guanidina (Trizol® (Invitrogen)), uno que utiliza bromuro de hexadecil trimetil amonio (CTAB) y el método fenol/cloroformo seguido por purificación con columnas de Sephadex; para detectar el virus por RT-PCR en: foliolo, peciolo, pedúnculo floral, pétalos, tallo aéreo y subterráneo, antera y brotes de tubérculo; de plantas infectadas. Los métodos de extracción fueron evaluados en términos de la integridad (relación de la intensidad de las bandas de las subunidades ribosomales 28S/18S), calidad (relación de las lecturas espectrofométricas 260/280nm) y rendimiento de los extractos. PYVV se detectó por RT-PCR en todos los órganos analizados por los tres métodos de extracción. No se presentaron diferencias estadísticamente significativas entre los tres métodos de extracción; sin embargo, Trizol® (Invitrogen) presentó mayor rendimiento, calidad e integridad; además, permitió la detección del virus por RT-PCR en todos los órganos evaluados.
Potato yellow vein virus (PYVV, Crinivirus/Closteroviridae), contains a tripartite genome with ssRNA(+), is phloem limited and can affect yield reduction. PYVV is a re-emergent virus and is a quarantine pathogen in Europe and United States. The detection has been based in RT-PCR, NASH and real time RT-PCR (RT-qPCR) in leaflets and tuber shoots samples. It is not known how is the distribution of PYVV within infected plants, for that is necessary to establish an efficient RNA isolation method for obtaining material from different organs. The objective of the present work was to evaluate three RNA isolation methods: a Trizol® (Invitrogen) based method, a method using hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB) and the phenol - chloroform method followed by Sephadex columns purification; for virus detection using RT-PCR in: leaflets, petiole, peduncle, petals, stem, aerial and subterranean roots, anther and shoot tuber; of infected plants. The isolation methods were tested in terms of integrity (ratio of band intensity of 28S and 18S ribosomal subunits), quality (absorbance 260/280 ratio) and total yield. PYVV was detected by RT-PCR in all organs analyzed by the three isolation methods. There were no significant differences found among the three isolation methods, although, Trizol® (Invitrogen) presented high yield, quality and integrity, furthermore Trizol® (Invitrogen) allowed the virus detection using RT-PCR in all analyzed organs.