RESUMO
The SPOT synthesis of peptide arrays on continuous cellulose membranes should be generally applicable in the analysis of sequential antibody binding sites using the enzyme-substrate or other standard detection protocols. The use of total serum is limited by the occurrence of high background levels. This may be overcome if affinity purified antibodies or sera with high antibody titers are used, which allows work at high dilutions and a consequent reduction of background level. Here we demonstrate the mapping of antigenic regions located on recombinant streptokinase SK-2 (Heberkinase) using cellulose-bound peptide scans and human total sera from patients treated with SK-2 (Heberkinase). Streptokinase (SK) is a 47 kDa protein produced by various strains of hemolytic streptococci and is a potent activator of the fibrinolytic enzyme system in humans. SK is in widespread clinical use to treat acute infarction because of its function as an activator of vascular fibrinolysis. Since streptococcal infections are common, normal individuals are immunized with SK and antibodies (Abs) to SK can be detected in most of them. This therapy generates significant T-cell responses to SK and the neutralizing capacity of the Abs rises significantly. Neutralizing Abs reduces the efficiency of thrombolytic therapy and may cause allergic reactions. The widespread use of SK in humans makes its antigenicity an important clinical problem. In this regard the study of the immunodominant regions of SK becomes an important aspect for the improvement of this thrombolytic agent.
Assuntos
Fibrinolíticos/uso terapêutico , Infarto do Miocárdio/tratamento farmacológico , Infarto do Miocárdio/imunologia , Biblioteca de Peptídeos , Análise Serial de Proteínas , Estreptoquinase/uso terapêutico , Sequência de Aminoácidos , Humanos , Modelos Moleculares , Dados de Sequência Molecular , Fragmentos de Peptídeos/síntese química , Fragmentos de Peptídeos/química , Conformação Proteica , Proteínas Recombinantes/química , Proteínas Recombinantes/uso terapêutico , Estreptoquinase/químicaRESUMO
Streptokinase (SK) is an efficacious thrombolytic drug for the treatment of myocardial infarction. Because of its immunogenicity, patients receiving SK therapy develop high anti-SK antibody (Ab) titers, which might provoke severe allergic reactions and neutralize SK activity. In this report we studied the reactivity of a synthetic 42-residue peptide resembling SKC-2 C-terminus with patient sera. SKC-2(373-414) peptide was recognized by 39 and 64% of patients, before and after SKC-2 therapy, respectively. An SKC-2 deletion mutant (mut-C42), lacking the same 42 C-terminal residues, was constructed and expressed in Escherichia coli. Recognition of mut-C42 by preexisting Abs from patient sera was 51 and 68% of reactivity to SKC-2, as assessed by direct binding and competition assays, respectively. For most of the patients, mut-C42-neutralizing activity titer (NAT) significantly decreased with respect to SKC-2-NAT. This study opens the possibility of producing a less immunogenic variant of SK, which could constitute a preferred alternative for thrombolytic therapy.
Assuntos
Anticorpos Antibacterianos/imunologia , Deleção de Sequência/genética , Estreptoquinase/química , Estreptoquinase/imunologia , Alérgenos/química , Alérgenos/imunologia , Anticorpos Antibacterianos/sangue , Antígenos de Bactérias/química , Antígenos de Bactérias/imunologia , Ligação Competitiva , Ensaio de Imunoadsorção Enzimática , Humanos , Epitopos Imunodominantes/química , Epitopos Imunodominantes/genética , Epitopos Imunodominantes/imunologia , Epitopos Imunodominantes/isolamento & purificação , Infarto do Miocárdio/tratamento farmacológico , Infarto do Miocárdio/imunologia , Testes de Neutralização , Fragmentos de Peptídeos/síntese química , Fragmentos de Peptídeos/química , Fragmentos de Peptídeos/genética , Fragmentos de Peptídeos/imunologia , Proteínas Recombinantes/química , Proteínas Recombinantes/genética , Proteínas Recombinantes/imunologia , Proteínas Recombinantes/isolamento & purificação , Estreptoquinase/genética , Estreptoquinase/uso terapêutico , Terapia TrombolíticaRESUMO
Streptokinase (SK) is a streptococcal protein widely used as a thrombolytic agent. Anti-SK antibodies (Abs) are found in most individuals due to common streptococcal infections. The presence of these Abs increases the possibility of allergic reactions and may reduce the thrombolytic efficacy of SK upon a first therapy. Previous studies report on the immunodominance of the SK C-terminus and the role of this region in plasminogen (Plg) activation. The aim of this study was to assess the prevalence of circulating Abs to the SK C-terminus in normal blood donors. Sera from 1008 subjects aged 30 to 60 years were tested by Ultra-Micro-ELISA using a synthetic peptide resembling the SKC-2 C-terminus. An overall prevalence of 30. 4% was found. Prevalence was significantly higher among male than among female donors (RR = 1.70, 1.13 < CI < 2.55). No age effect was observed. This is the first extensive study about Abs directed against a particular region of SK in normal subjects.
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Anticorpos Antibacterianos/sangue , Doadores de Sangue , Fragmentos de Peptídeos/imunologia , Infecções Estreptocócicas/imunologia , Estreptoquinase/imunologia , Adulto , Fatores Etários , Feminino , Humanos , Hipersensibilidade/etiologia , Hipersensibilidade/imunologia , Epitopos Imunodominantes , Masculino , Pessoa de Meia-Idade , Prevalência , Fatores Sexuais , Infecções Estreptocócicas/epidemiologia , Estreptoquinase/efeitos adversos , Terapia Trombolítica/efeitos adversosRESUMO
Streptokinase (SK) is efficaciously used as a thrombolytic drug for the treatment of myocardial infarction. Being a bacterial protein, SK is immunogenic in humans. Therefore, resulting from SK therapy, patients become immunized and anti-SK antibody (Ab) titers rise post-treatment. High Ab titers might provoke severe immune reactions during SK therapy and neutralize SK activity, preventing effective thrombolysis. Spot synthesis combined with peptide library techniques is a useful tool for studying protein-peptide interactions on continuous cellulose membranes. Here, we report on the mapping of antigenic regions of SK using a spot-synthesized peptide library and human total sera from patients receiving SK therapy. All tested samples have high anti-SK Ab titers and most of them show significant SK neutralizing capacity. Individual variations in peptide recognition were detected. However, patients treated with SK tend, in general, to show a common regional binding pattern, including residues 1-20, 130-149, 170-189, and 390-399. This is the first study reporting the probing of a cellulose-bound set of peptides with total human sera.
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Mapeamento de Epitopos/métodos , Infarto do Miocárdio/sangue , Estreptoquinase/imunologia , Sequência de Aminoácidos , Formação de Anticorpos , Proteínas de Bactérias/imunologia , Cuba , Humanos , Dados de Sequência Molecular , Infarto do Miocárdio/terapia , Fragmentos de Peptídeos/imunologia , Biblioteca de Peptídeos , Ligação Proteica/imunologia , Sorologia , Estreptoquinase/uso terapêuticoRESUMO
Streptokinase (SK) is the most widely used compound for the treatment of myocardial infarction and the least expensive thrombolytic agent, but a drawback to its use is the widespread presence of anti-SK antibodies (Abs). Clinical failure of the activation of the fibrinolytic system by SK has been reported due to the presence of a high titer of anti-SK neutralizing Abs. Patients receiving SK therapy develop high anti-SK antibody titers, which might provoke severe allergic reactions. These Abs are sufficient to neutralize a standard dose of SK up to four years after initial SK administration. This is a clinical problem because of the increasing number of patients who have been treated once with SK for acute myocardial infarction (AMI) and are likely to require plasminogen activator treatment in the future. In previous in vitro studies, we have shown that a deletion mutant (mut-C42), lacking the 42 C-terminal residues, was significantly less antigenic when compared with the native molecule (SKC-2). In this study, 14 monkeys were subjected to treatment with SKC-2 and mut-C42 in order to compare their humoral response by determining SK neutralizing activity in monkey's sera. All monkeys developed anti-SKC-2 Ab titers, but in the case where treatment induced Abs directed against the C-terminus of SKC-2, neutralizing activity against the native protein was significantly higher than that developed against mutant SK mut-C42.
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Fibrinolíticos/imunologia , Mutação , Fragmentos de Peptídeos/imunologia , Estreptoquinase/genética , Estreptoquinase/imunologia , Animais , Chlorocebus aethiops , Feminino , Fibrinolíticos/uso terapêutico , Masculino , Testes de Neutralização , Fragmentos de Peptídeos/uso terapêutico , Engenharia de Proteínas , Deleção de Sequência , Estreptoquinase/uso terapêutico , Trombose/tratamento farmacológicoRESUMO
La proquimosina de ternero fusionada al gen de la superóxido dismutasa humana (SOD) fue sintetizada en forma insoluble en Saccharomyces cerevisiae. Las condiciones que permiten la solubilización de la proteína fueron investigada, siendo la desnaturalización el proceso esencial mediante el cual es solubilizado más del 90 % del producto recombinante. Se estudiaron diferentes parámetros que intervienen en el proceso de renaturalización de la SOD proquimosina, describiéndose un procesamiento mediante el cual es posible recuperar el 25 % de la proquimosina soluble en su forma nativa. Más del 98 % de la proteína fue activada, obteniéndose un preparado enzimático cuya función biológica fue determinada mediante el proceso de coagulaciónm de la leche
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Bovinos , Quimosina , Saccharomyces cerevisiae , Superóxido Dismutase , CubaRESUMO
Se reporta el desarrollo de un micrométodo para la determinación de la actividad de la alcohol oxidasa en levaduras metilotróficas, basado en la gran cantidad de enzima que se acumula en estos microorganismos al crecerlos en presencia de metanol. El método es una modificación del anteriormente reportado por Ellis et al. (1985). La proporción de alcohol oxidasa en extractos celulares de Pichia pastoris y Hansenula polimorpha resultó ser muy alta: 32 % y 34 % de la proteina total respectivamente. La inducción de la enzima ocurre como parte de una respuesta fidiológica general al metanol, que incluye la inducción de otras proteinas y un aumento en el número y tamaño de los peroxisomas. Para obtener una alta actividad de alcohol oxidasa es necesario considerar tres parámetros sencillos: el tiempo de crecimiento en condiciones de represión, la densidad óptica en el momento de la inducción y la duración de la inducción
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Metanol , Leveduras , CubaRESUMO
Se examinó el efecto de las condiciones de cultivo en la producción de la proteina fusionada SOD-proquimosina sintetizada en Sacharomyces cerevisiae bajo el control del fragmento corto del promotor que regula la síntesis de la enzima gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa. El proceso fermentativo de 5 y 50 l de cultivo, obteniéndose resultados similares en ambas escalas. Cuando las células son cultivadas en medio selectivo suplementado con sacarosa al 5 % e hidrolizado de caseina al 2 % utilizando un sistema batch, la concentración relativa de SOD-proquimosina es incrementada 1,7 veces, mientras que la utilización del cultivo incrementado aumenta aproximadamente 4 veces la masa celular y eleva significativamente la producción de la proteina recombinante a un nivel del 2 % del total de la proteina celular
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Quimosina , Meios de Cultura , Saccharomyces cerevisiaeRESUMO
Kleyveromyces lactis es una levadura industrial cuyo uso como hospedero para la expresión de genes cobra interés creciente. El método de transformación desarrollado en el presente trabajo rinde 5x10*transformantes por microgramo de ADN replicativo y de 5 a 10 colonias x 10*g de ADN integrativo. Sólo el 16% de las colonias transformantes pierde la información que porta el lucus de integración, el resto permanece con fenotipo lac+. El gen de la renina del hongo Mucor pusillus fuevexpresado en Kluyveromyces lactis bajo el control del promotor LAC4 y la señal de secreción del factor * de Saccharomyces cerevisiae. La enzima fue secretada eficientemente al medio de cultivo y los niveles de secreción fueron dependientes de la adición de lactosa durante el crecimiento y del Ph de crecimiento
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Fungos/genética , Expressão Gênica , Kluyveromyces , Renina/metabolismoRESUMO
Los genes codificantes para los interferones alfa-2 y gamma humanos fueron clonados y expresados eficientemente bajo el control del promotor triptófano de E. coli. La adición de una señal de terminación de la transcripción en ambos ARNn dió como resultado un aumento de la expresión de las respectivas proteinas
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Escherichia coli/genética , Expressão Gênica , Interferon Tipo I , Transcrição GênicaRESUMO
El gen de la proquimosina de ternero (PQ) fue fusionado a la secuencia que codifica los primeros 41 aminoácidos de la superóxido dismutasa humana (SODh). Esta fusión se expresó en la levadura S. cerevisiae bajo el control del fragmento corto del promotor que regula la síntesis de la enzima gliceroaldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GFD) en este microorganismo. Los niveles de expresión de la proteina fusionada están en el orden del 2 % con respecto a la proteína total, produciéndose en forma insoluble y asociada a la membrana. El producto obtenido después de su activación presentó las mismas propiedades bioloógicas que la enzima natural
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Genes , Gliceraldeído-3-Fosfato Desidrogenases , Renina , Saccharomyces cerevisiae , Superóxido DismutaseRESUMO
En este trabajo se describe la clonación y la expresión en E. coli del gen de la quimosina, enzima de importancia industrial para la producción de quesos. Los clones se identificaron analizando una genoteca de ADN complementario al ARN poli (A) proveniente del estómago de ternero, utilizando como sonda dos oligonucléotidos sintéticos. La región del gen, codificante a la proquimosina, fue expresada bajo el control del promotor triptófano. Se alcanzó una expresión equivalente al 10 % de la proteína total. La proteína fue detectada insoluble y formando cuerpos de inclusión. La enzima producida demostró tener propiedades semejantes a la natural.