RESUMO
A exposição ou secreção de proteínas relacionadas a fatores de virulência de bactérias Gram-negativas é dependente de sistemas de transporte altamente especializados. O sistema de secreção tipo V é o responsável pelo transporte das proteínas autotransportadoras membros da família das Serino-Proteases Autotransportadoras de Enterobacteriaceae (SPATE), as quais diversas funções de virulência vêm sendo atribuídas. SPATEs têm sido descritas em bactérias isoladas de infecções gastrointestinais, trato urinário, meningite e sepse. O objetivo deste trabalho foi contribuir com os estudos de caracterização do papel das toxinas da família das serino-proteases autotransportadoras de Enterobacteriaceae Vat, Tsh e Sat na infecção bacteriana avaliando, particularmente, a funcionalidade da Tsh purificada por gel filtração. Inicialmente a cinética de crescimento de E. coli patogênicas das cepas EC120 vat+ ou EC077, EC046, EC153 e EC143 tsh+ foi realizada nos meios TSB, LB, DMEM e DMEM acrescido de 1% de triptona a fim de determinar o melhor meio e tempo de cultivo que favorece a secreção das proteínas autotransportadoras. Para a obtenção da Tsh, a cepa EC143 foi cultivada em meio LB. O sobrenadante do cultivo concentrado foi submetido à coluna de gel filtração e as frações foram analisadas por SDS-PAGE e Westen Blotting. A quantidade de proteína das frações contendo Tsh foi determinada e a avaliação da funcionalidade da toxina foi realizada pelo ensaio de hemaglutinação de eritrócitos de galinha, clássico para avaliar a atividade de Tsh. Paralelamente, Vat e Sat foram também submetidas à hemaglutinação. Os resultados mostraram que a funcionalidade da Tsh purificada por gel filtração é mantida, que Vat não tem capacidade hemaglutinante e que a determinação da capacidade hemaglutinante de Sat necessita de maiores estudos visto que em presença de PMSF (inibidor de serino protease) o resultado foi mantido. Como o PMSF pode estar danificando os eritrócitos, novos ensaios utilizando, por exemplo, anticorpos anti-Sat para neutralizar o efeito serão realizados.
RESUMO
As serino-proteases autotransportadoras de Enterobacteriaceae (SPATE) constituem uma família de proteases secretadas pelo sistema de secreção do tipo V, cujos genes foram estudados em Escherichia coli intestinal e extraintestinal. Vat é uma SPATE citotóxica de 140 kDa, a qual o gene foi identificado pela primeira vez em APEC (Avian Pathogenic Escherichia coli) isolado de colibacilose em frangos de corte ocasionando lesões em órgãos internos associados a septicemia. Estudos recentes analisam a relação desta citotoxina em cepas isoladas de infecção extraintestinais (ExPEC), principalmente E. coli isoladas de infecção urinária (UPEC) e septicemia. Além disso, o nosso grupo identificou o gene vat em cepas de E. coli enteropatogênica (EPEC). O objetivo deste trabalho foi contribuir para um projeto amplo sobre a expressão e função de Vat em E. coli patogênica humana, não APEC, identificando cepas de Escherichia coli patogênica (UPEC e EPEC) secretoras de Vat. Na confirmação da presença do gene vat em duas cepas de EPEC (BA 1250 e BA 1244) e uma UPEC (DV 33) constatou-se que a cepa BA 1244 não apresentava mais o gene e por isso esta cepa foi excluída do estudo. A presença de outras SPATEs como Pet e Pic que poderiam se presentes, interferir na identificação de Vat, também foram investigadas nas cepas DV 33 e BA 1250. Em nenhuma das duas cepas a expressão de Pet foi demonstrada. No entanto, a cepa DV 33 secretou Pic sendo está também excluída do estudo. As condições de cultivo da cepa BA 1250 para a obtenção do sobrenadante do cultivo, rico em proteínas, para a identificação de Vat foram padronizadas. Uma banda de massa molecular de 111 kDa que corresponde a massa molecular (sem a porção do β barril e peptídeo sinal) de Vat foi identificada. Uma nova corrida eletroforética será realizada a fim de se obter uma banda mais forte, bem delimitada que possibilite o envio para a identificação.