Hemaglutinação como um teste para avaliar a funcionalidade da toxina Tsh (Temperature-Sensitive Hemagglutinin) purificada por gel filtração

Matsumoto, Ana Julia

RESUMO

A exposição ou secreção de proteínas relacionadas a fatores de virulência de bactérias Gram-negativas é dependente de sistemas de transporte altamente especializados. O sistema de secreção tipo V é o responsável pelo transporte das proteínas autotransportadoras membros da família das Serino-Proteases Autotransportadoras de Enterobacteriaceae (SPATE), as quais diversas funções de virulência vêm sendo atribuídas. SPATEs têm sido descritas em bactérias isoladas de infecções gastrointestinais, trato urinário, meningite e sepse. O objetivo deste trabalho foi contribuir com os estudos de caracterização do papel das toxinas da família das serino-proteases autotransportadoras de Enterobacteriaceae Vat, Tsh e Sat na infecção bacteriana avaliando, particularmente, a funcionalidade da Tsh purificada por gel filtração. Inicialmente a cinética de crescimento de E. coli patogênicas das cepas EC120 vat+ ou EC077, EC046, EC153 e EC143 tsh+ foi realizada nos meios TSB, LB, DMEM e DMEM acrescido de 1% de triptona a fim de determinar o melhor meio e tempo de cultivo que favorece a secreção das proteínas autotransportadoras. Para a obtenção da Tsh, a cepa EC143 foi cultivada em meio LB. O sobrenadante do cultivo concentrado foi submetido à coluna de gel filtração e as frações foram analisadas por SDS-PAGE e Westen Blotting. A quantidade de proteína das frações contendo Tsh foi determinada e a avaliação da funcionalidade da toxina foi realizada pelo ensaio de hemaglutinação de eritrócitos de galinha, clássico para avaliar a atividade de Tsh. Paralelamente, Vat e Sat foram também submetidas à hemaglutinação. Os resultados mostraram que a funcionalidade da Tsh purificada por gel filtração é mantida, que Vat não tem capacidade hemaglutinante e que a determinação da capacidade hemaglutinante de Sat necessita de maiores estudos visto que em presença de PMSF (inibidor de serino protease) o resultado foi mantido. Como o PMSF pode estar danificando os eritrócitos, novos ensaios utilizando, por exemplo, anticorpos anti-Sat para neutralizar o efeito serão realizados.