RESUMO
Haemophilus influenzae type b (Hib) is a Gram-negative, facultative aerobic bacteria, responsible for respiratory infections, like pneumonia and meningitis, in children younger than 5 years. The main virulence factor of Hib is its capsular exopolysaccharide, Polyribosyl- Ribitol-Phosphate (PRP). Traditional PRP downstream processing comprises several steps of ethanol precipitation, centrifugation, ultracentrifugation, an also phenol extraction, resulting in a laborious, expensive and complex process. Therefore, a simpler and easily scalable process has been developed using tangential flow filtration (TFF) and ethanol precipitation steps. The aim of this work was to study the influence of the main variables during the microfiltration of the fermented broth for PRP recovery. Cell separation was performed at constant volume of 0.5 L, using a TFF system equipped with a Pellicon 2 Mini PVDF membrane (0.22 μm, 0.1 m2 ) and PBS pH 6.3 as dialysis buffer. Permeate flow was gradually increased during process, starting at 5 L.h-1.m-2 up to established values, in order to avoid membrane fouling. A full factorial experimental design was employed, in which three variables were combined at two levels, namely, TMP (15 and 30 psi), feed flow rate (400 and 500 L.h-1.m-2) and permeate flux (15 and 25 L.h-1.m-2), while temperature (22°C), PRP concentration (1 mg/mL), and broth volume/membrane area ratio (5 L/m2) remained constant. The effect of each variable was statistically evaluated by Analysis of Variance. The results indicate that TMP, feed flow, and permeate flow do not affect PRP retention by the membrane when evaluated independently. On the other hand, when combined on pairs or all simultaneously, these variables changed the PRP retention. The interaction between the higher experimental settings of TMP and feed flow or TMP and permeate flow increased PRP retention by around 8% and consequently reduced PRP recovery. Controlling these parameters is a promising strategy for the optimization of the broth clarification process, since the mean recovery observed in the trials was over 80%, in opposition to a mean recovery of around 60% obtained in former experiments.
Haemophilus influenzae tipo b (Hib) é uma bactéria Gram-negativa, aeróbia facultativa, responsável por infecções respiratórias, como pneumonia e meningite, em crianças menores de 5 anos. O principal fator de virulência do Hib é seu exopolissacarídeo capsular, Poliribosil- Ribitol-Fosfato (PRP). O processamento tradicional do PRP compreende várias etapas de precipitação com etanol, de centrifugação, de ultracentrifugação e de extração com fenol, resultando em um processo trabalhoso, caro e complexo. Desenvolveu-se, portanto, um processo mais simples e facilmente escalonável utilizando diversas etapas de filtração de fluxo tangencial (TFF), combinadas com etapas de precipitação com etanol. O objetivo deste trabalho foi estudar a influência das principais variáveis durante a microfiltração do caldo fermentado para a recuperação do PRP. A separação celular foi realizada a volume constante de 0,5 L, utilizando um sistema TFF equipado com uma membrana Pellicon 2 Mini PVDF (0,22 μm, 0,1 m2 ) e tampão fosfato salino pH 6,3 para a diálise. O fluxo de permeado foi gradualmente aumentado durante o processo, iniciando em 5 L.h-1.m-2 até valores estabelecidos, a fim de evitar o entupimento na membrana. Utilizou-se o delineamento experimental fatorial completo, no qual três variáveis foram combinadas em dois níveis: TMP (15 e 30 psi), fluxo de alimentação (400 e 500 L.h-1.m-2) e fluxo de permeado (15 e 25 L.h- 1 .m-2), enquanto a temperatura (22° C), a concentração de PRP (1 mg/mL) e a relação volume de caldo / área de membrana (5 L/m2) permaneceram constantes. O efeito das variáveis selecionadas foi avaliado estatisticamente pela Análise de Variância. Os resultados indicam que o fluxo de alimentação e o fluxo de permeado não afetam a retenção do PRP pela membrana quando avaliados de forma independente. Por outro lado, quando combinados em pares, essas variáveis alteraram a retenção do PRP. A interação entre as configurações experimentais mais altas de TMP e fluxo de alimentação aumentou a retenção de PRP em cerca de 8% e, consequentemente, reduziu a recuperação de PRP. O controle desses parâmetros é uma estratégia promissora para a otimização do processo de clarificação do caldo, uma vez que a recuperação média observada nos ensaios foi superior a 80%, contra uma recuperação média de cerca de 60% em experimentos anteriores.
RESUMO
Haemophilus influenzae type b (Hib) is a Gram-negative bacterium, responsible for serious infections, such as pneumonia, sepsis and meningitis, especially in children younger than 5 years old and immunocompromised individuals. The main virulence factor of Hib is its polyribosyl-ribitol-phosphate capsular exopolysaccharide (PRP), which is used in the formulation of Hib vaccines, conjugated to a carrier protein. The production of the conjugated vaccine is complex and costly, particularly the PRP purification process, that comprises several steps of ethanol precipitation and centrifugation, and uses organic solvents and detergents. Targeting a more affordable vaccine that meets the public health systems demands, the Process Development Laboratory of Butantan Institute has been developing a simpler, economical and easily scalable purification process based on tangential flow filtration. In this process, one major bottleneck is the broth clarification step by microfiltration, which results in low PRP recovery and high variability, probably due to membrane fouling. Regarding this matter, a small scale study was previously performed, in order to identify the best operational conditions of relevant process variables, namely transmembrane pressure (TMP), feed flow, and permeate flow. The aim of this work was to scale up the broth clarification step using the defined conditions for these parameters and to perform a critical flux analysis, which is a very useful tool in tangential flow filtration optimization. Although PRP recovery was relatively smaller in the higher scale (68.5% against 97.5%), the permeate flow and TMP profiles were very similar. Analysis of PRP recovery profile indicated that extending dialysis might improve PRP yield. Critical flux of around 35 L.h-1 .m-2 was determined experimentally, which explains the high PRP recovery when a limit permeate flux of 25 L.h-1 .m-2 was employed in the cell clarification step. In conclusion, the process designed for broth clarification is quite promising in terms of product yield and scalability.
Haemophilus influenzae do tipo b (Hib) é uma bactéria Gram-negativa, responsável por infecções graves, como pneumonia, sepse e meningite, especialmente em crianças menores de 5 anos de idade e indivíduos imunocomprometidos. Seu principal fator de virulência é o exopolissacarídeo capsular de poliribosil-ribitol- fosfato (PRP), que é utilizado na formulação de vacinas contra Hib, conjugado a uma proteína carreadora. A produção da vacina conjugada é complexa e onerosa, principalmente o processo de purificação do PRP, caracterizado por várias etapas de precipitação com etanol, centrifugação e uso de solventes orgânicos e detergentes. Buscando uma vacina mais acessível, que possa atender à demanda de sistemas públicos de saúde, o Laboratório de Desenvolvimento de Processos vem desenvolvendo nos últimos anos um método de purificação mais simples, econômico e facilmente escalonável, baseado em filtração tangencial. Nesse processo, um dos gargalos identificados é a etapa de separação celular por microfiltração, que apresentava baixa recuperação de PRP e alta variabilidade dos resultados, provavelmente relacionados ao fenômeno de fouling. Um estudo em pequena escala foi realizado previamente para identificar as melhores condições de variáveis operacionais relevantes - pressão transmembrana (TMP), fluxo de entrada e fluxo do filtrado. O presente trabalho teve como objetivos escalonar o processo, mantendo essas condições, e realizar uma análise do fluxo crítico do filtrado, ferramenta bastante útil para a otimização da filtração tangencial. Embora a recuperação de PRP tenha sido relativamente menor no processo escalonado (68,5% contra 97,5%), os perfis de fluxo do filtrado e de TMP se mostraram muito semelhantes, e as análises da tendência de recuperação mostram que um aumento no número de diavolumes utilizado pode contornar essa questão. O valor de fluxo crítico determinado experimentalmente foi próximo de 35 L.h-1 .m-2 , o que corrobora os bons resultados obtidos com o uso de fluxo limite de 25 L.h-1 .m-2 para o filtrado no processo de separação celular. Os resultados obtidos mostram que o desenho de processo estabelecido para a clarificação de PRP é bastante promissor em termos de rendimento de PRP e escalabilidade do processo.
RESUMO
Haemophilus influenzae type b (Hib), a Gram-negative capsulated bacterium, is a causative agent of meningitis worldwide. The capsular polysaccharide, a high molecular mass polymer consisting of the repeated units of the polyribosyl-ribitol-phosphate, is considered the main virulence factor and it is used as an antigen to vaccines, conjugated to a carrier protein. The industrial production of the polysaccharide requires the cultivation of Hib in rich medium, which impacts process costs and product recovery. In this study, a central composite rotational experimental design strategy was used to access the influence of key components of culture medium (soy peptone, yeast extract and glucose) on biomass formation and polysaccharide production in shake-flasks. The optimized medium formulation, containing half of the usual yeast extract and soytone concentrations, was further validated in batch bioreactor cultivations. High polysaccharide production (â¼500 mg/L) was obtained in a cheaper and more competitive production process for use in Hib vaccine production. In addition, simulations of a metabolic model describing Hib central metabolism were used to assess the role of key amino acids on growth. A chemically defined medium supplemented only with amino acids from α-ketoglutarate and oxaloacetate families as well as phenylalanine was suggested as a promising alternative for reduced acetate accumulation and enhanced polysaccharide production in Hib cultures. © 2017 American Institute of Chemical Engineers Biotechnol. Prog., 33:1508-1519, 2017.
Assuntos
Técnicas de Cultura de Células/métodos , Vacinas Anti-Haemophilus/biossíntese , Haemophilus influenzae tipo b/crescimento & desenvolvimento , Polissacarídeos/metabolismo , Cápsulas Bacterianas/genética , Cápsulas Bacterianas/metabolismo , Reatores Biológicos , Meios de Cultura , Vacinas Anti-Haemophilus/genética , Vacinas Anti-Haemophilus/metabolismo , Vacinas Anti-Haemophilus/uso terapêutico , Haemophilus influenzae tipo b/patogenicidade , Humanos , Meningite/microbiologia , Meningite/prevenção & controle , Análise do Fluxo Metabólico , Polissacarídeos/genética , Polissacarídeos/imunologiaRESUMO
The ribose-5-phosphate isomerase deficiency is an inherited condition, which results in cerebral d-arabitol and ribitol accumulation. Patients present leukoencephalopathy, mental retardation, and psychomotor impairment. Considering that the pathophysiology of this disorder is still unclear, and literature are sparse and contradictory, reporting pro and antioxidant activities of polyols, the main objective of this study was to investigate some parameters of oxidative homeostasis of prefrontal cortex of rats incubated with d-arabitol and ribitol. We found evidences that ribitol promoted an increase in antioxidant enzymes activity (superoxide dismutase, catalase, and glutathione peroxidase), probably secondary to enhanced production of superoxide radical, measured by flow cytometry. Oxidation of proteins and lipids was not induced by polyols. Our data allow us to conclude that, at least in our methodological conditions, arabitol and ribitol probably have a secondary effect on the pathophysiology of ribose-5-phosphate isomerase deficiency.