RESUMO
We investigated the use of multiprimer-PCR for detection of mycobacteria species in clinical samples. Three different mycobacterial genomic fragments were investigated: the IS6110 insertion sequence, present in M. tuberculosis complex; the genus specific fragment (32kDa); and from M. tuberculosis species-specific mtp40 gene. The sensitivity and specificity using 135 clinical isolates were 94.5% and 95.9%, respectively, compared with culture in Löwenstein-Jensen medium; the detection limit was 0.05ng of DNA. In conclusion, this assay is reliable and rapid for detection of Mycobacterium species in clinical samples, and differentiates M. tuberculosis from M. bovis strains in a single-step assay.
PCR utilizando vários oligonucleotídeos para detecção de espécies de micobactérias em espécimes clínicas foi padronizado. Três diferentes fragmentos genômicos: da seqüência de inserção IS6110, presente no complexo M. tuberculosis, do gene responsável por proteína específica (32kDa) do gênero e do gene mtp40 espécie-específico do M. tuberculosis foram estudados. A sensibilidade e especificidade do método em 135 amostras clínicas foram de 94.5% e 95.9%, respectivamente, comparados com os resultados da cultura em meio Löwenstein-Jensen, e o limite de detecção foi de 0.05 ng of DNA. O ensaio mostrou-se confiável e rápido para detecção de espécies de Mycobacterium em amostras clínicas, diferenciando M. tuberculosis de M. bovis em uma única reação.
RESUMO
We investigated the use of multiprimer-PCR for detection of mycobacteria species in clinical samples. Three different mycobacterial genomic fragments were investigated: the IS6110 insertion sequence, present in M. tuberculosis complex; the genus specific fragment (32kDa); and from M. tuberculosis species-specific mtp40 gene. The sensitivity and specificity using 135 clinical isolates were 94.5% and 95.9%, respectively, compared with culture in Löwenstein-Jensen medium; the detection limit was 0.05ng of DNA. In conclusion, this assay is reliable and rapid for detection of Mycobacterium species in clinical samples, and differentiates M. tuberculosis from M. bovis strains in a single-step assay.
PCR utilizando vários oligonucleotídeos para detecção de espécies de micobactérias em espécimes clínicas foi padronizado. Três diferentes fragmentos genômicos: da seqüência de inserção IS6110, presente no complexo M. tuberculosis, do gene responsável por proteína específica (32kDa) do gênero e do gene mtp40 espécie-específico do M. tuberculosis foram estudados. A sensibilidade e especificidade do método em 135 amostras clínicas foram de 94.5% e 95.9%, respectivamente, comparados com os resultados da cultura em meio Löwenstein-Jensen, e o limite de detecção foi de 0.05 ng of DNA. O ensaio mostrou-se confiável e rápido para detecção de espécies de Mycobacterium em amostras clínicas, diferenciando M. tuberculosis de M. bovis em uma única reação.
RESUMO
In this work, the prevalence of enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) in children in Londrina-PR, Brazil, was evaluated by means of digoxigenin-labelled DNA probes which identify the plasmid responsible for EPEC adherence factor (EAF), and virulence genes for EPEC as bundle-forming pilus (bfp) and E. coli attaching-effacing factor (eae). In addition, the isolated strains were serotyped and tested for adherence to HEp-2 cells. From 102 children with diarrhoea, 19 strains hybridized with at least one probe, and eleven of them were identified as typical EPEC because they hybridized with the three probes used, showed a localized adherence (LA) pattern, and presented no genes for enterotoxins (ST and LT) or invasion as detected by PCR. Six of the typical EPEC strains belonged to the classical serotype O119:H6 (43%); in four strains O antigens could not be determined using antisera against O1 to O173, they were all ONT:H7 (29%); one strain belonged to O111:H6. Three strains were classified as atypical EPEC: O26H-, O111:H9 and O119:HNT. Strains O26H- and O111:H9 hybridized with the eae probe only and showed localized adherence like (LAL) pattern; strain O119:HNT hybridized with the bfp and eae probes, and showed a localized adherence/diffuse adherence (LA/DA) pattern after 6 h. A DA pattern was observed in two strains isolated from children with diarrhoea (ONT:H11 and O142:H34), which hybridized with the eae probe. From 46 controls, five strains hybridized with one or two probes, but none hybridized with all probes or presented the LA pattern. Three strains with the DA pattern hybridized with the eae probe. No EPEC strain belonging to classical EPEC serotypes was isolated from faeces of control children.
A prevalência de Escherichia coli enteropatogênica (EPEC) em crianças em Londrina-PR, Brazil, foi avaliada através de sondas de DNA marcadas com digoxigenina, as quais identificam o plasmidio EAF (EPEC adherence factor) e os genes de virulência para EPEC, bfp (bundle-forming pilus) e eae (E. coli attaching and effacing). As amostras de E. coli foram também sorotipadas e testadas para a aderência às células HEp-2. Das 102 crianças com diarréia, 19 colonias de E. coli hibridizaram com pelo menos uma sonda, e destas, 11 foram identificadas como EPEC típica pois hibridizaram com as 3 sondas testadas. Todas as EPEC típicas apresentaram o padrão de aderência localizada e não apresentaram os genes para enterotoxinas (ST e LT) e invasão por PCR. Seis EPEC típica (43%) pertenceram ao sorotipo clássico O119:H6, uma ao sorotipo O111:H6 e em quatro amostras (29%) o antígeno O não foi determinado com os soros contra O1-O173 (ONT:H7). Três amostras foram classificadas como EPEC atípicas: O26H-, O111:H9 e O119:HNT. E. coli O26H- e O111:H9 hibridizaram somente com eae e mostraram padrão de aderência localizada "like" (LAL); O119:HNT hibridizou com as sondas bfp e eae, e mostrou padrão de aderência localizada/difusa (LA/DA) após 6 h. O padrão DA foi observado em duas amostras (ONT:H11 e O142:H34) isoladas de crianças com diarréia, as quais hibridizaram com eae. Dos 46 controles, cinco colônias hibridizaram com pelo menos uma sonda, mas nenhuma hibridizou com as 3 sondas testadas ou apresentou LA. Três amostras com padrão DA hibridizaram com sonda eae. Nenhuma EPEC com sorotipo clássico foi encontrada nas fezes de crianças controle.
RESUMO
Field and laboratory studies were conducted to assess the survival of cells and spores and plasmid transfer between Bacillus thuringienis strains in aquatic environment. Results indicated that cells and spores of B. thuringiensis can survive for 10 days in water, without altering their number. The sporulation process began after 12-15 hours of inoculation of water. B. thuringiensis was able to transfer conjugative plasmids in the aquatic environment.
O presente trabalho é um estudo sobre a sobrevivência e a conjugação de linhagens de Bacillus thuringiensis em água. Os experimentos conduzidos no laboratório mostram que as células e os esporos de B. thuringiensis podem persistir pelo menos 10 dias na água. A esporulação inicia-se 12-15 horas após a inoculação. O processo de conjugação foi demonstrado em diferentes ambientes aquáticos, tanto em condições de laboratório quanto no meio ambiente.