RESUMO

O melanoma é um tipo raro e agressivo de câncer de pele e a maioria dos casos é esporádica. Entretanto, alguns indivíduos da população apresentam alta predisposição ao desenvolvimento de tipos específicos de câncer em decorrência da presença de mutações germinativas e/ou variantes genômicas de risco. Aproximadamente 10% dos casos de melanoma cutâneo são causados por mutações germinativas, em especial no locus CDKN2A, responsável por até 40% do melanoma familial. Outros genes com mutações germinativas altamente penetrantes já foram descritos no melanoma, como CDK4, POT1, TERT, entre outros, mas tais mutações são detectadas em pouquíssimas famílias. Portanto, a etiologia genética da maior parte da predisposição ao melanoma cutâneo permanece não determinada. O objetivo central deste trabalho foi a identificação de variantes genômicas raras associadas à suscetibilidade ao melanoma cutâneo em pacientes negativos para mutações nos principais genes conhecidos. Dois tipos de abordagens metodológicas foram empregadas: o estudo de variações do número de cópias de segmentos genômicos (Copy Number Variation - CNV) e sequenciamento de exoma. A análise de CNV foi realizada em uma casuística constituída por um grupo de 41 pacientes de melanoma cutâneo não relacionados (selecionados como melanoma familial e/ou melanomas múltiplos), sem mutações nos genes de predisposição a melanoma CDKN2A, CDK4, MITF e TERT. Identificamos 10 CNVs raras não recorrentes, distribuídas em 9 dos pacientes (22% da coorte). Todas as CNVs foram validadas pela técnica de PCR quantitativo em tempo real (qPCR) e, adicionalmente, não foram detectadas em um grupo controle de 400 indivíduos. As CNVs detectadas afetam segmentos genômicos grandes (>200 Kb), compreendendo 3 deleções (2q33.3-q34, 6p24.3 e 10q22.3) e 7 duplicações (6p22.1, 10q22.3, 12p12.3, 20p12.1, 4q26-q27, 8q23.1 e 9p24.2). Dentre os genes afetados pela mudança no número de cópias, os principais genes candidatos à predisposição ao melanoma cutâneo são IDH1, ANXA11 e ANGPT1. Na segunda parte deste trabalho, um subgrupo de cinco famílias de melanoma familial, sendo 2 membros afetados de cada família e negativos para CNVs raras foram selecionados para o sequenciamento de exoma. Selecionamos apenas variantes genômicas não-sinônimas que fossem raras na população geral (frequência < 0,01%) segundo bancos de dados populacionais e que estivessem presentes nos dois afetados da família; dessa forma, foram identificadas um total de 214 variantes genômicas raras não-sinônimas em 210 genes. Dentre essas, 63 foram consideradas danosas à função proteica, segundo algoritmos de predição. Oito variantes ocasionam perda de função protéica (LoF ­ loss-of-function). Entre os 210 genes afetados, os genes MYO7A e WRN, já foram previamente associados à predisposição ao melanoma cutâneo. Adicionalmente, o grupo de genes identificados no exoma está associado a diferentes fenótipos como melanoma (ITGA3, RECK, ADAMTS4, TYMP e MCM3), pigmentação e pele (COL4A2, HPS5, MLPH, VNN2, NID2, SLIT2 e HMCN1), além de suscetibilidade a câncer em geral (ZFHX3 e CTBP2). Em conclusão, nossos dados revelaram alterações germinativas raras em pacientes de melanoma famílial e/ou melanomas múltiplos, como CNVs e mutações potencialmente patogênicas. Este estudo, portanto, identificou novos fatores genéticos de suscetibilidade ao melanoma cutâneo na população brasileira, contribuindo com vários genes candidatos a serem explorados em futuros trabalhos.

Melanoma is a rare and aggressive kind of skin cancer and sporadic on the most cases. However, some people of the population shows high predisposition to development of specific types of cancer due germline mutations and/or genomic variants of risk. Approximately 10% of all cases of melanoma are caused by germline mutations, specially affecting the CDKN2A locus, which responds up to 40% of familial melanoma cases. Other genes harboring penetrant mutations were already described in hereditary melanoma such as CDK4, POT1, TERT, among others, but these mutations are identified in few families. Therefore, the most part of genetic etiology to cutaneous melanoma predisposition remains not elucidated. The main objective of this work was to identify rare genomic variants associated to the cutaneous melanoma susceptibility in melanoma-prone patients negative for mutations at the main genes associated to this syndrome. Two kinds of methodological approaches were applied: the assess to genomic segments of copy number variations (CNV) through high resolution SNP-arrays and exome sequencing. The cohort of hereditary melanoma was composed by 41 not-related cutaneous melanoma patients, without mutations affecting genes of melanoma predisposition CDKN2A, CDK4, MITF and TERT. We identified 10 not recurrent rare CNVs in 9 patients (22% of our cohort). All CNVs were validated using the quantitative real-time PCR (qPCR) and were not detected in a control group of 400 individuals. These CNVs affected large genomic segments (>200 Kb), comprising 3 deletions (2q33.3-q34, 6p24.3 e 10q22.3) and 7 duplications (6p22.1 10q22.3 12p12.3 20p12.1, 4q26-q27, 8q23.1 e 9p24.2). From this analysis the main candidate genes were: IDH1, ANXA11 e ANGPT1. The exome sequencing was performed in a subset of 5 melanoma-prone families; 2 members affected by melanoma from each family without rare CNVs. We selected non-synonimous genomic variants following 2 main criteria: rarity on population (frequency <0.1%) and common variants between patient and their affected relative. We identified a total of 214 nonsynonimous rare genomic variants in all families affecting 210 genes, which 63 were considered damaging to protein function according to prediction algorithms and 8 leads to loss-of-function (LoF). Between the 210 affected genes, were highlighted variants affecting the MYO7A and WRN genes which were previously associated to melanoma predispodition. Additionally, the set of genes identified by exome sequencing also showed relevance once are associated to melanoma phenotypes (ITGA3, RECK, ADAMTS4, TYMP and MCM3), skin and pigmentation (COL4A2, HPS5, MLPH, VNN2, NID2, SLIT2 and HMCN1) and cancer susceptibility (ZFHX3 and CTBP2). In conclusion, our data revealed rare germline alterations in familial and/or multiple melanomas, such as CNV and potential pathogenic mutations. Therefore, this study identified new genetic factors of susceptibility to cutaneous melanoma on the Brazilian population, contributing with a set of candidate genes to be deeply explored in further studies.

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O câncer é uma doença complexa, decorrente do acúmulo de múltiplas e sucessivas mutações somáticas, resultando em modificações no funcionamento de genes que atuam em vias moleculares específicas, tais como controle de ciclo celular, apoptose, diferenciação e angiogênese. No estudo do genoma de tumores, um dos objetivos é identificar novos genes relacionados à carcinogênese, muitos deles possivelmente contidos em alterações cromossômicas. O câncer de mama é um modelo importante para estudos genômicos por se tratar de uma doença complexa e heterogênea, ainda não totalmente compreendida. Neste estudo, propusemos a investigação de alterações genômicas como ganhos e perdas de segmentos de DNA em carcinomas de mama do tipo ductal invasivo, buscando a identificação de perfis genômicos característicos de alguns diferentes subtipos deste câncer. Adicionalmente, buscamos estabelecer correlação entre as alterações genômicas encontradas e a ocorrência ou não de comprometimento linfonodal axilar ao diagnóstico. Foram investigados 71 carcinomas de mama invasivos, sendo 57 tumores primários do tipo ductal. A análise inicial do grupo de tumores detectou a ocorrência frequente (>20%) de ganhos nos cromossomos 1q, 8q, 16p, e na região 17q12-q21, enquanto que perdas recorrentes foram detectadas principalmente em 8p, 11q, 16q, e nos cromossomos 13 e 18. Foram identificadas 3828 alterações somáticas no número de cópias de segmentos genômicos (SCNAs), com número médio de 53 SCNAs por genoma tumoral e tamanho médio de 6,9 Mb. O perfil genômico de SCNAs diferiu entre os carcinomas de mama de acordo com o status de expressão do receptor de estrógeno (ER): foi detectada diferença estatística no número de SCNA por genoma tumoral e no tamanho dessas alterações, ambos maiores no grupo de tumores negativos quanto à expressão do receptor de estrógeno (ER(-)) quando comparado com o grupo expressando ER (ER(+)). Além disso, o perfil genômico de frequência de SCNA evidenciou que o grupo ER(-) apresenta uma variabilidade maior de regiões genômicas afetadas quando comparado ao grupo ER(+), com grandes regiões de perdas em 4q e 5q só detectadas nos tumores ER(-), além de ganhos focais em 10p e 17q. Por outro lado, o grupo de tumores ER(+) exibiu principalmente ganho em 16p. Na análise para a identificação de alterações genômicas relevantes para a presença de metástase em linfonodos axilares ao diagnóstico [Nx (linf(+)0], selecionamos apenas os 57 carcinomas de mama invasivos do tipo ductal. Verificamos ganhos mais frequentes nos tumores Nx (linf(+)) em 5p, 7p, 8q, 10p e no cromossomo 19; o grupo de tumores sem acometimento linfonodal exibe SCNAs mais concentradas em outras regiões do genoma, como perdas em 1p e 9p e ganho em 16p. A última etapa de nossa análise foi investigar as regiões genômicas afetadas por SCNAs de maior amplitude, como ganhos em alto número de cópias e deleções em homozigose, excluindo aquelas já associadas à tumorigênese em mama. Essa análise foi realizada apenas no grupo de carcinomas de mama com metástase linfonodal ao diagnóstico, uma vez que estávamos buscando identificar potenciais oncogenes e genes supressores tumorais associados à progressão tumoral. Sete genes mapeados nestas regiões afetadas por SCNAs de maior amplitude foram selecionados para validação técnica. Tais genes, candidatos a novos genes relevantes para a progressão do câncer de mama foram validados e são: KISS1, ADAMTS3 e HSD17B12 (detectados em amplicons) e ZBTB20, MTAP, ELF5 e RERGL (afetados por deleção em homozigose).

Cancer is a complex disease caused by the accumulation of multiple and successive somatic mutations, resulting in modifications in gene functions that act on specific molecular pathways, such as cycle cell control, apoptosis, differentiation and angeiogenesis. On tumor genome studies one of the aims is to identify new genes related to carcinogenesis, a lot of them possibly restrained on the chromosomal alterations. The breast cancer is an important model to genomic studies because it is a complex and heterogeneous disease, not fully understood yet. In this study, we proposed to evaluate the genomic alterations as gains and losses of DNA segments in ductal invasive breast carcinomas, seeking to identify characteristic genomic profiles of some different subtypes of this cancer. Moreover, we seek to establish a correlation between the genomic alterations found and the occurrence or not of axillary limph nodal involvement at diagnosis. It was investigated 72 breast carcinomas of ductal invasive type. The initial analysis of the tumor group detected the frequent occurrence (>20%) of gains on chromossomes 1q, 8q, 16p and 17q12-q21 region, while recurrent losses were detected mainly at 8p, 11q, 16q and on the chromossomes 13 and 18. It was identified 3828 copy number somatic alterations in genomic segments (SCNAs), with an average number of 53 per tumoral genome and an average size of 6,9 Mb. Loss events showed a higher significantly size (p<0,0001) than gain events, and high amplitude events (amplicons and homozygous losses) affected significantly smaller genomic segments. The genomic profile of SCNA differed also between the breast carcinomas according to the estrogen receptor (ER) expression status: it was detected significant difference on the SCNA number per tumoral genome and on the size of this alterations, that were both greater in the group of estrogen receptor negative tumors (ER(-)) when compared to the expressing group (ER(+)). Furthermore, the genomic profile of SCNAs showed that the ER(-) group has a greater variability of affected genomic regions when compared to ER(+) group, with large losses mapped at 4q and 5q, besides focal gains that were identified at 10p and 17q; the ER(+) tumor group showed a high frequency of 16p gain. We also directed the analysis to identify relevant genomic alterations possibly related to the presence of metastasis at axillary lymph nodes at diagnosis [Nx(linf(+))]. Gains were frequent on Nx (linf(+)) tumors at 5p, 7p, 8q 10p and chromosome 19, while a frequent loss was detected at 8p; the carcinomas withouth lymph nodes metastasis exibithed a different profile, with SCNAs concentrated in other regions of the genome such as 1p and 9p losses and 16p gain. The last step of our analysis was to investigate genomic regions affected by high amplitude SCNAs (high copy number gains=amplicons, and homozygous deletions), excluding those already related to the breast tumorigenesis. This analysis was performed only on the breast carcinoma group with lymph node metastasis at diagnosis, since we were seeking to identify potential oncogenes and tumor suppressor genes associated with the cancer progression. Genes mapped on seven regions affected by high amplitude SCNAs were selected to technical validation. These new relevant candidate genes in breast cancer progression are: KISS1, ADAMTS3 and HSD17B12 (mapped at amplicons) and ZBTB20, MTAP, ELF5 and RERGL (affected by homozygous deletion). The final purpose of a study like ours is to enlarge the knowledgement to obtain defined gene signatures to each tumor, possibiliting more effective individualized treatments

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Introduction: Neurofibromatosis-Noonan syndrome is a clinical entity considered an extended Neurofibromatosis phenotype generally caused by different types of intragenic mutations at the NF1 gene. About 5%-10% of patients with neurofibromatosis diagnosis carry chromosomal microdeletions involving NF1, often presenting with a more severe phenotype than that observedin the patients carrying intragenic mutations; however, anticipating the presence of a deletion based only in the phenotype is not straightforward. Patient and Methods: Here we investigated by oligoarray-CGH (aCGH) the presence of a submicroscopic genomic rearrangement in a patientwith a clinical picture of Neurofibromatosis, and other characteristics compatible with Noonansyndrome. Results: The aCGH analysis revealed a germline de novo ~1.3 Mb microdeletion at 17q11.2 encompassing other coding genes besides the NF1 gene. Discussion: Up to now, thenumber of reported patients with Neurofibromatosis-Noonan syndrome carrying NF1 microdeletions is quite small. The continuous identification of patients carrying 17q11.2 deletions canhelp to establish a reliable genotype-phenotype relationship in this syndrome

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