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Comparison of techniques for corneal epithelium cell culture for the collection of conditioned medium / Comparação das técnicas de cultivo de células epiteliais da córnea para a coleta de meio condicionado
Viveiros, Magda Massae Hata; Zucoloto, Luís Henrique; Shiguematsu, Álvio Issao; Rainho, Cláudia Aparecida; Schellini, Silvana Artioli.
Afiliação
  • Viveiros, Magda Massae Hata; Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho,. Faculdade de Medicina de Botucatu. Department of Ophthalmology. Botucatu. BR
  • Zucoloto, Luís Henrique; Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho,. Faculdade de Medicina de Botucatu. Botucatu. BR
  • Shiguematsu, Álvio Issao; Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho,. Faculdade de Medicina de Botucatu. Department of Ophthalmology. Botucatu. BR
  • Rainho, Cláudia Aparecida; Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho. Instituto de Biociências de Botucatu. Department of Chemical and Biological Sciences. Botucatu. BR
  • Schellini, Silvana Artioli; Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho,. Faculdade de Medicina de Botucatu. Department of Ophthalmology. Botucatu. BR
Arq. bras. oftalmol ; Arq. bras. oftalmol;87(2): e2022, 2024. tab, graf
Article em En | LILACS-Express | LILACS | ID: biblio-1557082
Biblioteca responsável: BR1.1
ABSTRACT
ABSTRACT

Purposes:

To determine the best protocol in obtaining the higher yield of conditioned culture medium to be used for the bone marrow mesenchymal stem cell differentiation into corneal epithelial cells, five techniques for the primary culture of human corneal epithelial cells were evaluated.

Methods:

The studied culture techniques of corneal epithelial cells were explants in culture flasks with and without hydrophilic surface treatment, on amniotic membrane, with enzymatic digestion, and by corneal scraping. The conditioned culture medium collected from these cultures was used to differentiate human bone marrow mesenchymal stem cells into corneal epithelial cells, which were characterized using flow cytometry with pan-cytokeratin and the corneal-specific markers, cytokeratin 3 and cytokeratin 12.

Results:

The culture technique using flasks with hydrophilic surface treatment resulted in the highest yield of conditioned culture medium. Flasks without surface treatment resulted to a very low success rate. Enzymatic digestion and corneal scraping showed contamination with corneal fibroblasts. The culture on amniotic membranes only allowed the collection of culture medium during the 1st cell confluence. The effectiveness of cell differentiation was confirmed by cytometry analysis using the collected conditioned culture medium, as demonstrated by the expressions of cytokeratin 3 (95.3%), cytokeratin 12 (93.4%), and pan-cytokeratin (95.3%).

Conclusion:

The culture of corneal epithelial cell explants in flasks with hydrophilic surface treatment is the best technique for collecting a higher yield of conditioned culture medium to be used to differentiate mesenchymal stem cells.
RESUMO
RESUMO

Objetivos:

Foram estudadas cinco técnicas de cultivo primário de células epiteliais de córnea humana para se determinar o melhor protocolo para a obtenção do maior rendimento de meio de cultivo condicionado para ser utilizado na diferenciação de células tronco mesenquimais para células epiteliais de córnea.

Métodos:

As técnicas de cultivo estudadas foram explantes em frascos de cultivo com e sem tratamento hidrofílico de superfície, sobre membrana amniótica, com digestão enzimática e por raspado de córnea. O meio de cultivo condicionado foi coletado e as células tronco mesenquimais induzidas a se diferenciarem em células epiteliais da córnea utilizando o meio de cultivo condicionado. As células foram caracterizadas por citometria de fluxo com pan-citoqueratina e com os marcadores específicos da córnea, citoqueratina 3 e citoqueratina 12.

Resultados:

A técnica utilizando frascos com o tratamento de superfície apresentou o maior rendimento de meio de cultivo condicionado. Os frascos sem tratamento de superfície levaram a uma taxa de sucesso muito baixa. A digestão enzimática e a raspagem da córnea mostraram contaminação das culturas com fibroblastos de córnea. A cultura sobre membranas amnióticas só permitiu a coleta do meio de cultivo condicionado durante a 1ª confluência celular. A análise de citometria de fluxo confirmou o sucesso da diferenciação celular utilizando o meio de cultivo condicionado coletado, demonstrada pela expressão de citoqueratina 3 (95,3%), citoqueratina 12 (93,4%) e pan-citoqueratina (95,3%).

Conclusão:

O cultivo de explantes de células tronco mesenquimais em frascos com tratamento hidrofílico de superfície é a melhor técnica para a obtenção de um alto rendimento de meio de cultivo condicionado.
Palavras-chave

Texto completo: 1 Coleções: 01-internacional Base de dados: LILACS Idioma: En Revista: Arq. bras. oftalmol Assunto da revista: OFTALMOLOGIA Ano de publicação: 2024 Tipo de documento: Article / Project document País de afiliação: Brasil País de publicação: Brasil

Texto completo: 1 Coleções: 01-internacional Base de dados: LILACS Idioma: En Revista: Arq. bras. oftalmol Assunto da revista: OFTALMOLOGIA Ano de publicação: 2024 Tipo de documento: Article / Project document País de afiliação: Brasil País de publicação: Brasil