Impacto do Complexo Repressor Polycomb 2 (PRC2) na modulação in vitro de células T CD8+ humanas / Impact of Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) on the in vitro modulation of human CD8+ T cells
São Paulo; s.n; 2023. 62 p. ilus, tab.
Thesis
em Pt
| Inca
| ID: biblio-1433907
Biblioteca responsável:
BR30.1
Localização: BR30.1
RESUMO
INTRODUÇÃO:
Células T CD8+ citotóxicas (CTLs) têm como principal atributo a capacidade de reconhecer e eliminar células-alvo que apresentem epítopos não próprios. Na resposta anti-tumoral, a estimulação persistente ao antígeno pode levar à indução da exaustão de tais células, que passam a apresentar um aumento na expressão de marcadores inibitórios, tornando-as disfuncionais. Nesse contexto, lançamos a hipótese de que mecanismos epigenéticos podem agir como indutores de programas intracelulares envolvidos na supressão de CTLs e que a manipulação farmacológica do epigenoma pode contribuir para a potencialização da resposta citotóxica ao aumentar a capacidade antitumoral dessas células.METODOLOGIA:
Foi avaliada inicialmente a atividade modulatória de inibidores de diferentes subunidades do complexo repressor polycomb 2 (PRC2) sobre a função efetora de linfócitos T CD8+ humanos isolados a partir de PBMCs de doadores saudáveis. Além disso, desenvolvemos um sistema de células CAR-T antiCD19 utilizando metodologias não-virais de inserção gênica como o sistema transposontransposase Sleeping Beauty (SB), que representa uma alternativa mais acessível comparada à abordagem tradicional e possibilita a entrega do transgene por eletroporação, agilizando o processo de geração das células CAR-T.RESULTADOS:
A inibição das subunidades EED e EZH2 através das sondas epigenéticas A395 e GSK343, respectivamente, aumentou e sustentou ao longo de uma cinética temporal a expressão de marcadores de ativação (CD25 e CD69), mediadores inflamatórios (IFN-γ e TNF-α) e granzima B (GzmB), principal mediador citotóxico produzido por linfócitos T CD8+ , sem que houvesse perda de viabilidade celular. Ademais, a inibição do complexo PRC2 impactou discretamente a proliferação de células T CD8+ , enquanto diminuiu a frequência de marcadores inibitórios como PD1. Utilizando-se dados públicos de expressão gênica de células T CD8+ de camundongos estimuladas in vitro por 72h com anti-CD3/CD28, a deleção condicional de EZH2 promoveu o aumento da expressão gênica de citocinas, quimiocinas e de seus receptores, além da maquinaria de citotoxicidade, o que favoreceu o enriquecimento de vias relacionadas à citotoxicidade celular e à capacidade efetora. Para validarmos o potencial antitumoral citotóxico de linfócitos T CD8+ após a repressão do PRC2, tratamos células CAR-T anti-CD19 com os inibidores GSK343 e A395, os quais também favoreceram o aumento da expressão de mediadores antitumorais e reduziram a expressão de PD1. Além disso, células CAR-T anti-CD19 tratadas com inibidores de PRC2 eliminaram as células de linhagem tumoral de Leucemia Linfoblástica Aguda de células B (LLA-B) CD19+ Nalm-6 mais eficientemente em comparação com células CAR-T anti-CD19 tratadas com os controles negativos.CONCLUSÃO:
A inibição do complexo PRC2 potencializou a produção de mediadores inflamatórios e citotóxicos pelas células T CD8 ou células CAR-T. Portanto, nossos resultados sugerem que a modulação epigenética por meio da inibição deste complexo pode ser uma abordagem terapêutica promissora no tratamento oncológico.ABSTRACT
INTRODUCTION:
Cytotoxic CD8+ T lymphocytes (CTLs) are the main cells responsible for the recognition and elimination of tumor cells. During antitumor responses, chronic antigen stimulation induces CTL exhaustion, which is characterized by the progressive accumulation of inhibitory markers and suboptimal functional properties. Here, we hypothesized that epigenetic mechanisms govern CTL functions, and that pharmacological approaches capable of modulating the CTL epigenome can improve their cytotoxic activity, leading to an improved antitumor response.METHODS:
We evaluated the modulatory effect of inhibitors that target different subunits of the Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) on the function of human CD8+ T lymphocytes from healthy PBMCs. In addition, we have developed anti-CD19 CAR-T cells using the Sleeping Beauty (SB) transposon-transposase system, a non-viral gene insertion method.RESULTS:
The inhibition of the EED and EZH2 subunits using the epigenetic probes A395 and GSK343 increased and sustained across time the CTL expression of activation markers (i.e., CD25 and CD69), inflammatory mediators (i.e., IFN-γ and TNF-α) and the main cytotoxic granule granzyme B (GzmB), without affecting the CTL viability. In addition, the PRC2 inhibition showed a subtle impact on the CTL proliferation. Furthermore, the use of the epigenetic probes seemed to mitigate the CTL exhaustion process, as seen by the lower expression of PD1 upon PRC2 inhibition when compared with untreated cells. Taking advantage of publicly available transcriptome data from murine CD8+ T cells polyclonally stimulated with anti-CD3/CD28 for 72h, we found that the conditional deletion of EZH2 upregulated the gene expression of cytokines, chemokines/receptors, and the whole cytotoxic machinery, which favored the enrichment of pathways associated with cell cytotoxicity and effector-like cells. In line with this, the PRC2 inhibition of anti-CD19 CAR-T cells also potentiated the expression of antitumor (Gzmb) and inflammatory (IFN- ï§ and TNF-ï¡) mediators when compared to the control groups. Moreover, inhibition of the PRC2 complex also seemed to have an impact on CAR-T cell exhaustion, as PD1 was dramatically reduced after the treatment. To validate the antitumor cytotoxic potential of CD8+ T lymphocytes after PRC2 repression, we cocultured CAR-T cells with LLA-B CD19+ Nalm-6 tumor lineage cells and found that the PRC2 inhibition eliminated more efficiently the target cells compared to the control group.CONCLUSION:
The PRC2 inhibition potentiated inflammatory and cytotoxic mediators of human lymphocytes and led to improved antitumor activity of CAR-T cells. Therefore, our results suggest that epigenetic modulation through the inhibition of this complex can be a promising therapeutic approach in cancer treatment.Palavras-chave
Texto completo:
1
Base de dados:
Inca
Assunto principal:
Linfócitos T Citotóxicos
/
Complexo Repressor Polycomb 2
Idioma:
Pt
Ano de publicação:
2023
Tipo de documento:
Thesis
País de publicação:
Brasil