Bothrops insularis é uma espécie endêmica da Ilha da Queimada Grande, São Paulo, considerada ameaçada de extinção. Em decorrência da sua vulnerabilidade, são mantidas cinco populações de B. insularis em plantéis de quatro institutos de ensino e pesquisa para fins de reprodução e conservação ex situ. Nos últimos anos, essa espécie tem sido alvo de estudos relacionados à história natural, evolução, ecologia e composição de seu veneno. Entretanto, existem poucos relatos sobre a diversidade genética das populações existentes, informação crucial para a condução e manutenção de programas de conservação. Neste contexto, o presente estudo objetivou caracterizar e comparar a diversidade da população ex situ mantida no Laboratório Especial de Ecologia e Evolução do Instituto Butantan com alguns exemplares da população in situ, por meio de 12 marcadores microssatélites heteroespecíficos dese nvolvidos para três espécies de Bothrops do grupo neuwiedi, bem como testar a hipótese de estruturação e divergência genética inter e intrapopulacional. Os resultados mostraram que as populações apresentaram baixos/médios índices de diversidade genética, sendo a maior diversidade genética observada na população ex situ. Ambas as populações apresentam baixos, porém significativos, graus de endogamia de grau de parentesco, como esperado para populações de espécies ameaçadas de extinção e com restrita distribuição geográfica. Adicionalmente, foram recuperados valores negativos de endogamia de sistema de acasalamento, possivelmente relacionado a existência de processos que evitem a endogamia nas populações. As divergências interpopulacionais das frequências alélicas e a existência de alelos privados observados podem estar relacionados a efeitos de deriva genética, eventos demográficos recentes e/ou a ausência de amostras de uma região da ilha. Apesar dessas divergências, nenhum dos índices de diferenciação populacional apresentou valores significativos e, portanto, não há indícios de diferenciação genética entre as populações. Quando as amostras são estudadas em conjunto, as análises de distância genética e de componentes discriminantes principais (DAPC) sugerem a existência de cinco agrupamentos genéticos, porém tais agrupamentos não recuperam as relações geográficas dos espécimes da população in situ, e não são totalmente explicados por relações de consanguinidade. Além das informações inéditas apresentadas no presente estudo, consideramos importante que abordagens futuras utilizem novos marcadores moleculares (como SNPs e/ou novos microssatélites) para a melhor compreensão da diversidade genética e para investigar a estrutura genética populacional de Bothrops insularis.