RESUMO
Abstract Introduction: The use of electron microscopy in the study of the inner ear has allowed us to observe minute details of the hair cells, especially in ototoxicity studies; however, the preparation of this material is a difficult and delicate task. In an attempt to simplify the handling of these materials, two agents, toluidine blue and ethylenediamine tetra-acetic acid were tested, in addition to the elimination of osmium tetroxide during the preparation of albino guinea pig cochleae. We also tested the applicability of these methodologies in an ototoxicity protocol. Objective: To verify the quality of the images obtained with and without the use of ethylenediamine tetra-acetic acid, toluidine blue and osmium tetroxide in the preparation of cochleae of albino guinea pigs for the scanning electron microscopy. Methods: Three groups of cochleae were used. In Group 1, 10 cochleae were prepared with the usual methodology, dissecting the optical capsule without decalcification and using osmium tetroxide as a post-fixative agent. In Group 2, we prepared 10 cochleae decalcified with ethylenediamine tetra-acetic acid, injecting toluidine blue in the endolymphatic space to facilitate the identification of the organ of Corti. In Group 3, we used 4 cochleae of guinea pigs that received 3 doses of cisplatin (7.5 mg/kg, D1-D5-D6), two prepared according to the methodology used in Group 1 and two with that used in Group 2. Scanning electron microscopy images were obtained from the organ of Corti region of the basal turn of each cochlea. Results: The organ of Corti was more easily identified with the use of toluidine blue. The dissection of the cochlea was more accurate in the decalcified cochleae. The quality of the images and the preservation of the organ of Corti obtained with the two methodologies were similar. Conclusion: The proposed modifications resulted in images of similar quality as those observed using the traditional methodology.
Resumo Introdução: O emprego da microscopia eletrônica no estudo da orelha interna permitiu observar detalhes minuciosos das células ciliadas especialmente em estudos de ototoxicidade. Entretanto, o preparo desse material é trabalhoso e delicado. Para simplificar a manipulação desses materiais, testou-se o uso de dois agentes, azul de toluidina e ácido etilenodiamino tetra-acético, além da retirada do tetróxido de ósmio na preparação de cócleas de cobaias albinas. Testamos também a aplicabilidade dessas metodologias em um protocolo de ototoxicidade. Objetivo: Verificar a qualidade das imagens obtidas com e sem o uso de ácido etilenodiamino tetra-acético, azul de toluidina e tetróxido de ósmio na preparação de cócleas de cobaias albinas para a microscopia eletrônica de varredura. Método: Foram utilizados três grupos de cócleas. No Grupo 1 preparou-se 10 cócleas com a metodologia usual, dissecando a cápsula ótica sem descalcificac¸ão e utilizando tetróxido de ósmio como pós-fixador. No Grupo 2 preparamos 10 cócleas descalcificadas com ácido etilenodiamino tetra-acético, injetando azul de toluidina no espac¸o endolinfático para facilitar a identificação do órgão de Corti. No Grupo 3 utilizamos 4 cócleas de cobaias que receberam 3 doses de cisplatina (7,5 mg/kg, D1-D5-D6), duas preparadas com a metodologia do Grupo 1 e duas com a do Grupo 2. Foram obtidas imagens da microscopia eletrônica de varredura da região do órgão de Corti do giro basal de cada cóclea. Resultados: O órgão de Corti foi mais facilmente identificado com o azul de touidina. A dissecção da cóclea foi mais precisa nas cócleas descalcificadas A qualidade das imagens e a preservac¸ão do órgão de Corti obtidas com as duas metodologias foi similar. Conclusão: As modificações propostas resultaram em imagens de qualidade similar as observadas com o uso da metodologia tradicional.
Assuntos
Animais , Feminino , Cisplatino/toxicidade , Cóclea/efeitos dos fármacos , Cóclea/ultraestrutura , Órgão Espiral/efeitos dos fármacos , Órgão Espiral/ultraestrutura , Tetróxido de Ósmio/administração & dosagem , Cloreto de Tolônio/administração & dosagem , Microscopia Eletrônica de Varredura , Ácido Edético/administração & dosagem , Cobaias , Células Ciliadas Auditivas/efeitos dos fármacos , Células Ciliadas Auditivas/ultraestruturaRESUMO
INTRODUCTION: The use of electron microscopy in the study of the inner ear has allowed us to observe minute details of the hair cells, especially in ototoxicity studies; however, the preparation of this material is a difficult and delicate task. In an attempt to simplify the handling of these materials, two agents, toluidine blue and ethylenediamine tetra-acetic acid were tested, in addition to the elimination of osmium tetroxide during the preparation of albino guinea pig cochleae. We also tested the applicability of these methodologies in an ototoxicity protocol. OBJECTIVE: To verify the quality of the images obtained with and without the use of ethylenediamine tetra-acetic acid, toluidine blue and osmium tetroxide in the preparation of cochleae of albino guinea pigs for the scanning electron microscopy. METHODS: Three groups of cochleae were used. In Group 1, 10 cochleae were prepared with the usual methodology, dissecting the optical capsule without decalcification and using osmium tetroxide as a post-fixative agent. In Group 2, we prepared 10 cochleae decalcified with ethylenediamine tetra-acetic acid, injecting toluidine blue in the endolymphatic space to facilitate the identification of the organ of Corti. In Group 3, we used 4 cochleae of guinea pigs that received 3 doses of cisplatin (7.5mg/kg, D1-D5-D6), two prepared according to the methodology used in Group 1 and two with that used in Group 2. Scanning electron microscopy images were obtained from the organ of Corti region of the basal turn of each cochlea. RESULTS: The organ of Corti was more easily identified with the use of toluidine blue. The dissection of the cochlea was more accurate in the decalcified cochleae. The quality of the images and the preservation of the organ of Corti obtained with the two methodologies were similar. CONCLUSION: The proposed modifications resulted in images of similar quality as those observed using the traditional methodology.
Assuntos
Cisplatino/toxicidade , Cóclea/efeitos dos fármacos , Cóclea/ultraestrutura , Animais , Ácido Edético/administração & dosagem , Feminino , Cobaias , Células Ciliadas Auditivas/efeitos dos fármacos , Células Ciliadas Auditivas/ultraestrutura , Microscopia Eletrônica de Varredura , Órgão Espiral/efeitos dos fármacos , Órgão Espiral/ultraestrutura , Tetróxido de Ósmio/administração & dosagem , Cloreto de Tolônio/administração & dosagemRESUMO
As características tridimensionais dos componentes intracelulares de células acinares e de ductos foram reveladas usando o método ósmio-DMSO-ósmio. As amostras foram maceradas em solução de tetróxido de ósmio diluído após a fratura na solução de dimetil sulfoxido. As lamelas do retículo endoplasmático granular são reveladas entremeadas por várias mitocôndrias. As lamelas do retículo endoplasmático granular são localizados ao redor dos núcleos na porção basal e estas estruturas são observadas em imagens tridimensionais de microscopia eletrônica de alta resolução.
The three-dimensional characteristics of the intracellular components of acinar and ductal cells were revealed using the osmium-DMSO-osmium method. The samples were macerated in diluted osmium after fractured in DMSO solution. The stacks of the rough endoplasmic reticulum are revealed intermingling by several mitochondria. The lamellae of the rough endoplasmic reticulum are located around the nuclei at basal portion and these structures are shown in three-dimensional HRSEM images.
Assuntos
Animais , Dimetil Sulfóxido/administração & dosagem , Glândula Submandibular/citologia , Glândula Submandibular/ultraestrutura , Glândula Submandibular , Microscopia Eletrônica/métodos , Ratos , Tetróxido de Ósmio/administração & dosagemRESUMO
As características tridimensionais dos componentes intracelulares de células acinares e de ductos foram reveladas usando o método ósmio-DMSO-ósmio. As amostras foram maceradas em solução de tetróxido de ósmio diluído após a fratura na solução de dimetil sulfoxido. As lamelas do retículo endoplasmático granular são reveladas entremeadas por várias mitocôndrias. As lamelas do retículo endoplasmático granular são localizados ao redor dos núcleos na porção basal e estas estruturas são observadas em imagens tridimensionais de microscopia eletrônica de alta resolução.(AU)
The three-dimensional characteristics of the intracellular components of acinar and ductal cells were revealed using the osmium-DMSO-osmium method. The samples were macerated in diluted osmium after fractured in DMSO solution. The stacks of the rough endoplasmic reticulum are revealed intermingling by several mitochondria. The lamellae of the rough endoplasmic reticulum are located around the nuclei at basal portion and these structures are shown in three-dimensional HRSEM images.(AU)