RESUMO
In this study we report the cloning and sequencing of a cDNA for cholesterol side chain cleavage cytochrome P450scc from Syrian hamster adrenal glands. Isolation of P450scc mRNA was carried out with degenerate primer PCR together with 5' and 3' RACE protocol. The full-length cDNA comprises an open reading frame of 1563 bp encoding a polypeptide of 520 amino acid residues. The predicted protein sequence exhibits well-preserved heme- and steroid-binding domains and shares 89% amino acid sequence identity with rat and mouse enzymes. Transient transfection of HEK-293 cells with the cloned cDNA leads to the formation of pregnenolone from 25-hydroxycholesterol. Northern blot analysis showed expression of mRNAs for P450scc in the major steroidogenic tissues, namely, the adrenal cortex, testis, and ovary. In addition, tissue distribution analysis using the coupled reaction of RT-PCR and Southern blotting revealed that the mRNA of the enzyme is also expressed in various nonendocrine tissues, including the epididymis, Harderian gland, and lungs. The relative abundance of specific transcripts at these novel sites suggests that P450scc could potentially play an important role in regulating local steroid hormone synthesis.
Assuntos
Glândulas Suprarrenais/enzimologia , Enzima de Clivagem da Cadeia Lateral do Colesterol/genética , Clonagem Molecular , DNA Complementar/genética , Expressão Gênica , Sequência de Aminoácidos , Animais , Sequência de Bases , Northern Blotting , Southern Blotting , Linhagem Celular , Enzima de Clivagem da Cadeia Lateral do Colesterol/química , Cricetinae , Embrião de Mamíferos , Humanos , Rim , Mesocricetus/genética , Dados de Sequência Molecular , Fases de Leitura Aberta , Reação em Cadeia da Polimerase , RNA Mensageiro/análise , RNA Mensageiro/isolamento & purificação , Reação em Cadeia da Polimerase Via Transcriptase Reversa , TransfecçãoRESUMO
El presente estudio describe la técnica utilizada para la obtención de óvulos de Hámster Dorado (mesocricetus Aurratus Waterhouse) libres de zona pelúcida útiles para estudios de Biología Reproductiva. Cinco grupos de Hámster Dorado con 5 hembras cada uno fueron inducidas a superovular al administrar por vía intraperitoneal gonadotropina sérica de yegua preñada a diferentes dosis, el grupo testigo recibió solo 0.25 ml de agua estéril. Las hembras estimuladas produjeron en total 653 óvulos con un promedio de 32.65 y un rango de 16 a 52, en cambio el grupo testigo produjo en total 50 óvulos con un promedio de 10.0 y un rango de 0 a 14. Por parte, la dosis de 25 U.I. degonadotropina sérica de yegua preñada (GSYP) fue la óptima en cuanto a la mayor producción de óvulos maduros, al obtener un promedio de 39.0 (D.E. ñ10.93)(n = 195 óvulos). Así mismo, fueron determinadas las condiciones favorables para la denudación de los óvulos. El cumulus oophorus fue degradado con hialuronidasa al 0.01 por ciento por un tiempo medio de 10'00" (D.E. ñ 03'56") y la zona pelúcida fue disuesta con tripsina al 0.20 por ciento en 03'20" (D.E. ñ 01'19"). Conjuntamente se determinó por tincipon supravital con Eosina Y, que el 100 por ciento de los óvulos maduros (n = 681) no resultaron afectados por los procesos enzimáticos y de manipulación utilizados para su denudación. finalmente los óvulos libres de zona pelúcida fueronfijados con ácido acético al 1 por ciento y teñidos con Azul de metileno al 0.01 por ciento ambos por un tiempo de 1 a 3 minutos.ñ Con ésto se establece que la técnica implementada produce un número de óvulos suficientes para llevar a cabo ensayos biológicos y que los óvulos permanecen viables aún después de su denundación. Estos gametos brindan la posibilidad de substituir a los óvulos humanos cuando se estudian algunos aspectos de la biología reproductiva humana evitando con ello problemas de tipo práctico, ético y moral.