RESUMO
BACKGROUND: Leishmaniasis, one of the most neglected diseases, is a serious public health problem in many countries, including Brazil. Currently available treatments require long-term use and have serious side effects, necessitating the development of new therapeutic interventions. Because translocator protein (TSPO) levels are reduced in Leishmania amazonensis-infected cells and because this protein participates in apoptosis and immunomodulation, TSPO represents a potential target for Leishmania chemotherapy. The present study evaluated PK11195, a ligand of this protein, as an anti-leishmanial agent. OBJECTIVE: To evaluate the leishmanicidal activity of PK11195 against L. amazonensis in infected CBA mouse macrophages in vitro. METHODS: The viability of axenic L. amazonensis, Leishmania major, and Leishmania braziliensis promastigotes was assessed after 48 h treatment with PK11195 (0.2-400 µM). Additionally, intracellular parasite viability was evaluated to determine IC50 values and the number of viable parasites in infected macrophages treated with PK11195 (50-100 µM). Infected macrophages were then treated with PK11195 (25-100 µM) to determine the percentage of L. amazonensis-infected cells and the number of parasites per infected cell. Electron microscopy was used to investigate morphological changes caused by PK11195. The production of free oxygen radicals, nitric oxide, and pro-inflammatory cytokines was also evaluated in infected macrophages treated with PK11195 and primed or not primed with IFN-γ. FINDINGS: Median IC50 values for PK11195 were 14.2 µM for L. amazonensis, 8.2 µM for L. major, and 3.5 µM for L. braziliensis. The selective index value for L. amazonensis was 13.7, indicating the safety of PK11195 for future testing in mammals. Time- and dose-dependent reductions in the percentage of infected macrophages, the number of parasites per infected macrophage, and the number of viable intracellular parasites were observed. Electron microscopy revealed some morphological alterations suggestive of autophagy. Interestingly, MCP-1 and superoxide levels were reduced in L. amazonensis-infected macrophages treated with PK11195. MAIN CONCLUSIONS: PK11195 causes the killing of amastigotes in vitro by mechanisms independent of inflammatory mediators and causes morphological alterations within Leishmania parasites, suggestive of autophagy, at doses that are non-toxic to macrophages. Thus, this molecule has demonstrated potential as an anti-leishmanial agent.
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Isoquinolinas/farmacologia , Leishmania braziliensis/efeitos dos fármacos , Leishmania major/efeitos dos fármacos , Leishmania mexicana/efeitos dos fármacos , Macrófagos/parasitologia , Animais , Leishmania braziliensis/ultraestrutura , Leishmania major/ultraestrutura , Leishmania mexicana/ultraestrutura , Dose Letal Mediana , Camundongos , Camundongos Endogâmicos CBA , Microscopia Eletrônica de Transmissão , Testes de Sensibilidade Parasitária , Fatores de TempoRESUMO
A source of chemotherapeutic failure in anti-infective therapies is the active movement of drugs across membranes, through ATP-binding cassette (ABC) transporters. In fact, simultaneous administration of therapeutic drugs with ABC transporter blockers has been invoked to be the way to actively prevent the emergence of drug resistance. Herein, we demonstrate that glucantime's efficacy in decreasing the infection rate of Leishmania-infected macrophages is strongly enhanced when used in combination with glibenclamide, a specific blocker of ABC transporters. Intracellular ABC transporters mediate glucantime sequestration in intracellular organelles. Their selective inhibition may effectively increase the cytoplasmic concentration of glucantime and its leishmanicidal activity. Our results reveal for the first time that glibenclamide targets in Leishmania major a compartment associated with a multivesicular system that is simultaneously labeled by the acidic marker LysoTracker-red and may represent the organelle where antimonials are sequestered. These results constitute a proof of concept that conclusively demonstrates the potential value that combination therapy with an ABC transporter blocker may have for leishmaniasis therapy.
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Antiprotozoários/farmacologia , Glibureto/farmacologia , Leishmania major/efeitos dos fármacos , Meglumina/farmacologia , Compostos Organometálicos/farmacologia , Transportadores de Cassetes de Ligação de ATP/antagonistas & inibidores , Anfotericina B/farmacologia , Animais , Antiprotozoários/metabolismo , Células Cultivadas , Sinergismo Farmacológico , Glibureto/metabolismo , Leishmania major/metabolismo , Leishmania major/ultraestrutura , Macrófagos Peritoneais/parasitologia , Meglumina/metabolismo , Antimoniato de Meglumina , Camundongos , Camundongos Endogâmicos BALB C , Microscopia Eletrônica , Compostos Organometálicos/metabolismoRESUMO
Characterization of infective metacyclic promastigotes of Leishmania spp can be an essential step in several experimental protocols. Metacyclic forms of all Leishmania species display a typical morphology with short, narrow cell body, and an elongated flagellum. This feature suggests that metacyclics can be distinguished from procyclic forms by non-fluorimetric flow cytometric parameters thus enabling the follow-up of their appearance and acquisition of specific properties, during metacyclogenesis in in vitro cultures. Here we describe the flow cytometric parameters of stage-specific promastigotes of Leishmania major, Leishmania donovani, Leishmania amazonensis, and Leishmania braziliensis. Our findings were validated by optical microscopy morphology and specific procyclic labeling with FITC-peanut agglutinin. Furthermore, we show that parasite's distribution in the plot during differentiation in culture is not species specific and that the parasites displaying low forward-angle light scatter (FSC(low)) are three times more infective than the FSC(high) ones. The method here described can be applied to the identification of metacyclics of different Leishmania spp within the whole stationary population.
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Leishmania/crescimento & desenvolvimento , Animais , Células Cultivadas , Citometria de Fluxo , Humanos , Leishmania/isolamento & purificação , Leishmania/ultraestrutura , Leishmania braziliensis/crescimento & desenvolvimento , Leishmania braziliensis/isolamento & purificação , Leishmania braziliensis/ultraestrutura , Leishmania donovani/crescimento & desenvolvimento , Leishmania donovani/isolamento & purificação , Leishmania donovani/ultraestrutura , Leishmania major/crescimento & desenvolvimento , Leishmania major/isolamento & purificação , Leishmania major/ultraestrutura , Leishmania mexicana/crescimento & desenvolvimento , Leishmania mexicana/isolamento & purificação , Leishmania mexicana/ultraestrutura , Estágios do Ciclo de Vida , Macrófagos Peritoneais/parasitologia , Camundongos , Camundongos Endogâmicos BALB C , Reprodutibilidade dos Testes , Especificidade da EspécieRESUMO
Snake venom can affect the growth of Trypanosoma cruzi and Leishmania spp. As new classes of therapeutic drugs against protozoan parasites could be derived from snake venom, alterations in the ultrastructure and growth of the epimastigotes, trypomastigotes and amastigotes of T. cruzi, as well as the promastigotes of Leishmania major, were analyzed after treatment with crude venom from Bothrops jararaca. Parasite growth (epimastigotes and promastigotes) of venom treated cultures showed a negative correlation between cell growth and venom concentration. No growth occurred at a dose of 100 microg/ml of venom, while 50% growth inhibition was obtained in the range 0.1-0.3 microg/ml. Ultrastructural observations of treated bloodstream trypomastigotes, intracellular amastigotes, as well as axenic cultures of epimastigotes and promastigotes, demonstrated mitochondrial swelling and kinetoplast disorganization. Our data show that B. jararaca venom effectively inhibited the growth of T. cruziand L. major parasites. Growth inhibition was probably related to mitochondrial impairment.
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Antiprotozoários/toxicidade , Venenos de Crotalídeos/toxicidade , Leishmania major/ultraestrutura , Trypanosoma cruzi/ultraestrutura , Animais , Bothrops , Sobrevivência Celular/efeitos dos fármacos , Chlorocebus aethiops , Leishmania major/efeitos dos fármacos , Leishmania major/crescimento & desenvolvimento , Microscopia Eletrônica , Trypanosoma cruzi/efeitos dos fármacos , Trypanosoma cruzi/crescimento & desenvolvimento , Células VeroRESUMO
A leishmaniose é uma doença endêmica que está distribuída por todo o mundo e é causada pelo protozoário do gênero Leishmania. Este parasita existe em duas formas: promastigotas (flagelados) no intestino do inseto vetor, e amastigotas (intracelulares) que vivem e se multiplicam dentro de macrófagos no hospedeiro vertebrado. As formas promastigotas, quando são inoculadas no hospedeiro vertebrado pelo inseto vetor, infectam macrófagos. Estas células são infectadas pelo parasita após um processo de reconhecimento mútuo entre as superficies do protozoário e da célula hospedeira. Questões cruciais sobre como as moléculas da superficie do parasita participam desse processo têm sido exaustivamente estudadas e, aos poucos respondidas. Sabe-se que in vitro todos os promastigotas são capazes de se aderir e entrar na células hospedeiras. Porém, apenas os que passaram pelo processo de metaciclogênese, os metacíclicos, são infectantes. Estudos demonstraram que nesse processo de diferenciação ocorrem modificações na mais abundante molécula expressa na superfície do parasita, o lipofosfoglicano (LPG). Nesse estudo, usamos o anticorpo 79.3, marcador de LPG, a fim de observar a distribuição dessa molécula durante a fase inicial de adesão e posterior interiorização de formas promastigotas por macrófago peritonial de camundongo. Por imunofluorescência, foi possível observar a marcação das superficies dos parasitas aderidos aos macrófagos. Comparamos então a entrada e a destruição dos procíclicos (promastigotas não infectantes) com a sobrevivência e manutenção da infecção fato sugere que a molécula é secretada durante a interação parasitacélula.
A molécula de LPG foi constante e uniformemente identificada em toda a superficie do parasita. Importante fato foi a presença do LPG na área de adesão com a célula hospedeira. A marcação permaneceu intensa durante toda a entrada do parasita. Após a completa interiorização, o parasita continua com a superfície marcada e secretando o LPG. A molécula parece então ser sequestrada de dentro do vacúolo parasitóforo em vesículas, que se apresentam distribuidas por todo o citoplasma do macrófago. Além disto, experimentos com Western bloting demonstraram o aparecimento de uma nova banda de 21kDa, depois de 24 horas de interação com a célula hospedeira. Estes resultados mostram que a molécula de LPG esta envolvida e parece ser de grande importância nos primeiros momentos da invasão dos promastigotas no macrófago. Além do mais, o comportamento do LPG dentro do macrófago infectado sugere sua participação em possíveis mecanismos que garantam a permanência do parasita dentro da célula hospedeira.
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Eletroforese em Gel de Poliacrilamida/métodos , Leishmania major/ultraestrutura , Leishmania/parasitologia , Endocitose/imunologia , Citometria de Fluxo/métodos , Imunofluorescência/métodos , Macrófagos/parasitologia , Microscopia Eletrônica/métodosRESUMO
A leishmaniose é uma doença endêmica que está distribuída por todo o mundo e é causada pelo protozoário do gênero Leishmania. Este parasita existe em duas formas: promastigotas (flagelados) no intestino do inseto vetor, e amastigotas (intracelulares) que vivem e se multiplicam dentro de macrófagos no hospedeiro vertebrado. As formas promastigotas, quando são inoculadas no hospedeiro vertebrado pelo inseto vetor, infectam macrófagos. Estas células são infectadas pelo parasita após um processo de reconhecimento mútuo entre as superficies do protozoário e da célula hospedeira. Questões cruciais sobre como as moléculas da superficie do parasita participam desse processo têm sido exaustivamente estudadas e, aos poucos respondidas. Sabe-se que in vitro todos os promastigotas são capazes de se aderir e entrar na células hospedeiras. Porém, apenas os que passaram pelo processo de metaciclogênese, os metacíclicos, são infectantes. Estudos demonstraram que nesse processo de diferenciação ocorrem modificações na mais abundante molécula expressa na superfície do parasita, o lipofosfoglicano (LPG). Nesse estudo, usamos o anticorpo 79.3, marcador de LPG, a fim de observar a distribuição dessa molécula durante a fase inicial de adesão e posterior interiorização de formas promastigotas por macrófago peritonial de camundongo. Por imunofluorescência, foi possível observar a marcação das superficies dos parasitas aderidos aos macrófagos. Comparamos então a entrada e a destruição dos procíclicos (promastigotas não infectantes) com a sobrevivência e manutenção da infecção fato sugere que a molécula é secretada durante a interação parasitacélula. A molécula de LPG foi constante e uniformemente identificada em toda a superficie do parasita. Importante fato foi a presença do LPG na área de adesão com a célula hospedeira. A marcação permaneceu intensa durante toda a entrada do parasita. Após a completa interiorização, o parasita continua com a superfície marcada e secretando o LPG. A molécula parece então ser sequestrada de dentro do vacúolo parasitóforo em vesículas, que se apresentam distribuidas por todo o citoplasma do macrófago. Além disto, experimentos com Western bloting demonstraram o aparecimento de uma nova banda de 21kDa, depois de 24 horas de interação com a célula hospedeira. Estes resultados mostram que a molécula de LPG esta envolvida e parece ser de grande importância nos primeiros momentos da invasão dos promastigotas no macrófago. Além do mais, o comportamento do LPG dentro do macrófago infectado sugere sua participação em possíveis mecanismos que garantam a permanência do parasita dentro da célula hospedeira.