RESUMO
Flagella are effective organelles of locomotion and one of several virulence factors in Proteus mirabilis. To study their properties and role in virulence, we describe a protocol to extract and purify the native flagellin of P. mirabilis. Purified flagellin can be visualized by SDS-PAGE or immunoblot and is suitable for downstream applications such as immunization.
Assuntos
Flagelina/isolamento & purificação , Proteus mirabilis/metabolismo , Centrifugação , Eletroforese em Gel de Poliacrilamida , Flagelos/metabolismo , Fenômenos Mecânicos , Proteus mirabilis/patogenicidade , VirulênciaRESUMO
The major contamination sources, biofilm-forming ability and biocide resistance of Staphylococcus aureus in tilapia-processing plants were evaluated. Twenty-five processing control points were analysed twice in two factories, including whole tilapias, frozen fillets, water and food-contact surfaces. No final product was contaminated with S. aureus. However, high concentrations of S. aureus carrying enterotoxin ( se) genes were found in several processing points of both factories due to the application of inadequate hygienic and handling procedures, which generate a high risk of cross-contamination of the tilapia fillets with staphylococcal enterotoxins. Nine S. aureus strains were characterized by RAPD-PCR using primers AP-7, ERIC-2 and S. A wide diversity of se gene profiles was detected, most strains being multi- se-carriers. All S. aureus strains showed high biofilm-forming ability on stainless steel and polystyrene. Biofilm-forming ability was correlated with the presence of fliC H7 and the type of origin surface (metallic or plastic). A marked resistance of S. aureus to peracetic acid and sodium hypochlorite was also observed, required doses being higher than those recommended by manufacturers to be eradicated. Case-by-case approaches are thus recommended to determine the sources and degree of contamination present in each factory, which would allow applying precise responses that avoid, or at least reduce, the presence of bacterial pathogens and the emergence of antimicrobial resistance.
Assuntos
Biofilmes/crescimento & desenvolvimento , Contaminação de Alimentos/prevenção & controle , Indústria de Processamento de Alimentos/instrumentação , Alimentos Congelados , Alimentos Marinhos , Staphylococcus aureus/fisiologia , Tilápia , Animais , Aquicultura , Carga Bacteriana , Biofilmes/efeitos dos fármacos , Brasil , Desinfetantes/farmacologia , Farmacorresistência Bacteriana Múltipla , Enterotoxinas/genética , Enterotoxinas/isolamento & purificação , Enterotoxinas/metabolismo , Flagelina/genética , Flagelina/isolamento & purificação , Flagelina/metabolismo , Alimentos Congelados/microbiologia , Testes de Sensibilidade Microbiana , Tipagem Molecular , Ácido Peracético/farmacologia , Poliestirenos , Alimentos Marinhos/microbiologia , Hipoclorito de Sódio/farmacologia , Aço Inoxidável , Staphylococcus aureus/classificação , Staphylococcus aureus/efeitos dos fármacos , Staphylococcus aureus/isolamento & purificação , Tilápia/crescimento & desenvolvimento , Tilápia/microbiologia , Microbiologia da ÁguaRESUMO
The aim of this study was to separate, purify, and identify Salmonella paratyphi A flagellin, and to prepare its antisera. Primary flagellin was isolated from S. paratyphi A using the acid lysis method. The flagellin was purified with weak anion exchange chromatography and the protein was identified with sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), Western blot, and negative staining with phosphotungstic acid with scanning electron microscopy (SEM). The production of the obtained flagellin was then quantified. New Zealand white rabbits were then immunized with the isolated flagellin, the presence of serum anti-flagellin antibodies was assessed with the immunoblot test, and its potency was determined with the double immunodiffusion test. The results of SDS-PAGE showed that the molecular weight (m.w.) of the purified flagellin was 52 x 10(3). The immunoblot test also showed a band at 52 x 10(3) m.w. The SEM results showed that the flagellin was filamentous. These three results showed that the protein was homogeneous. The protein quantification analysis found that 4.8 ± 0.5 mg flagellin could be extracted per 1 g wet weight bacteria. The titer of the anti-flagellin antiserum was 1:64. Through this method, we obtained high productions of flagellin, which could be easily purified, identified, and prepared into high titer antiserum.
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Flagelina/imunologia , Flagelina/isolamento & purificação , Soros Imunes/imunologia , Salmonella paratyphi A/metabolismo , Animais , Western Blotting , Cromatografia por Troca Iônica , Misturas Complexas , Eletroforese em Gel de Poliacrilamida , Flagelina/ultraestrutura , Microscopia Eletrônica de Varredura , CoelhosRESUMO
The recombinant production of innate immune system pattern recognition receptor agonists has provided a new tool for the production of immunostimulants for animals. The molecular pattern associated with the pathogen (PAMP), flagellin, coded by the fljB gene from Salmonella Typhimirium, and the molecular pattern associated to the damage (DAMP), HSP60, coded by the groEL gene from S. Typhimurium and S. Enteritidis, are recognized by pattern recognition receptors (PRRs) of the innate immune system of birds. In the present study, we performed the cloning of genetic fragments of the genes fljB, from S. Typhimurium, and groEL from S. Typhimurium and S. Enteritidis inserted in expression vector pET100/D-TOPO and transformed in E. coli TO10 cells. The clones were evaluated by colony PCR, plasmidial DNA PCR and genome sequencing in order to confirm the presence of these genes. In the colony PCR, we identified the presence of genes groEL (S. Enteritidis), groEL (S. Typhimurium) and fljB (S. Typhimurium) in 80%, 60% and 80% of the transformed colonies, respectively. The cloning system adopted allowed the production of HSP60 genetic fragment clones and flagellin of Salmonella strains, allowing the posterior use of these clones in gene expression trials, with the future potential of being used as non-specific immunostimulants for birds.(AU)
A produção recombinante de agonistas dos receptores do reconhecimento de padrão do sistema imune inato tem fornecido uma nova ferramenta para a produção de imunoestimulantes para animais. O padrão molecular associado ao patógeno (PAMP), flagelina, codificado pelo gene fljB de Salmonella Typhimurium e o padrão molecular associado ao dano (DAMP) HSP60, codificado pelo gene groEL da S. Typhimurium e S. Enteritidis, são reconhecidos por receptores de reconhecimento de padrões (RRPs) do sistema imune inato das aves. No presente estudo, foi feita a clonagem de fragmentos genéticos dos genes fljB de S. Typhimurium e groEL de S. Typhimurium e S. Enteritidis inseridos no vetor de expressão pET100/D-TOPO e transformados em células de E. coli TOP10. Os clones foram avaliados pela PCR de colônia, PCR de DNA plasmidial e sequenciamento genômico para a confirmação da presença desses genes. Na PCR de colônia, foram identificadas em 80%, 60% e 80% das colônias transformadas, a presença dos genes groEL (S. Enteritidis), groEL (S. Typhimurium) e fljB (S. Typhimurium) respectivamente. O sistema de clonagem adotado possibilitou a produção de clones dos fragmentos genéticos da HSP60 e flagelina das cepas de Salmonella, permitindo a utilização posterior desses clones em ensaios de expressão gênica, com potencial futuro de serem utilizados como imunoestimulante inespecífico das aves.(AU)
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Animais , Aves/imunologia , Adjuvantes Imunológicos/genética , Clonagem Molecular , Salmonella typhimurium/isolamento & purificação , Salmonella enteritidis/isolamento & purificação , Flagelina/isolamento & purificação , Reação em Cadeia da Polimerase/veterinária , Eletroforese em Gel de Ágar/veterináriaRESUMO
The recombinant production of innate immune system pattern recognition receptor agonists has provided a new tool for the production of immunostimulants for animals. The molecular pattern associated with the pathogen (PAMP), flagellin, coded by the fljB gene from Salmonella Typhimirium, and the molecular pattern associated to the damage (DAMP), HSP60, coded by the groEL gene from S. Typhimurium and S. Enteritidis, are recognized by pattern recognition receptors (PRRs) of the innate immune system of birds. In the present study, we performed the cloning of genetic fragments of the genes fljB, from S. Typhimurium, and groEL from S. Typhimurium and S. Enteritidis inserted in expression vector pET100/D-TOPO and transformed in E. coli TO10 cells. The clones were evaluated by colony PCR, plasmidial DNA PCR and genome sequencing in order to confirm the presence of these genes. In the colony PCR, we identified the presence of genes groEL (S. Enteritidis), groEL (S. Typhimurium) and fljB (S. Typhimurium) in 80%, 60% and 80% of the transformed colonies, respectively. The cloning system adopted allowed the production of HSP60 genetic fragment clones and flagellin of Salmonella strains, allowing the posterior use of these clones in gene expression trials, with the future potential of being used as non-specific immunostimulants for birds.
A produção recombinante de agonistas dos receptores do reconhecimento de padrão do sistema imune inato tem fornecido uma nova ferramenta para a produção de imunoestimulantes para animais. O padrão molecular associado ao patógeno (PAMP), flagelina, codificado pelo gene fljB de Salmonella Typhimurium e o padrão molecular associado ao dano (DAMP) HSP60, codificado pelo gene groEL da S. Typhimurium e S. Enteritidis, são reconhecidos por receptores de reconhecimento de padrões (RRPs) do sistema imune inato das aves. No presente estudo, foi feita a clonagem de fragmentos genéticos dos genes fljB de S. Typhimurium e groEL de S. Typhimurium e S. Enteritidis inseridos no vetor de expressão pET100/D-TOPO e transformados em células de E. coli TOP10. Os clones foram avaliados pela PCR de colônia, PCR de DNA plasmidial e sequenciamento genômico para a confirmação da presença desses genes. Na PCR de colônia, foram identificadas em 80%, 60% e 80% das colônias transformadas, a presença dos genes groEL (S. Enteritidis), groEL (S. Typhimurium) e fljB (S. Typhimurium) respectivamente. O sistema de clonagem adotado possibilitou a produção de clones dos fragmentos genéticos da HSP60 e flagelina das cepas de Salmonella, permitindo a utilização posterior desses clones em ensaios de expressão gênica, com potencial futuro de serem utilizados como imunoestimulante inespecífico das aves.
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Animais , Adjuvantes Imunológicos/genética , Aves/imunologia , Clonagem Molecular , Flagelina/isolamento & purificação , Salmonella enteritidis/isolamento & purificação , Salmonella typhimurium/isolamento & purificação , Eletroforese em Gel de Ágar/veterinária , Reação em Cadeia da Polimerase/veterináriaRESUMO
Identification of Escherichia coli requires knowledge regarding the prevalent serotypes and virulence factors profiles allows the classification in pathogenic/non-pathogenic. However, some of these bacteria do not express flagellar antigen invitro. In this case the PCR-restriction fragment length polymorphism (RFLP-PCR) and sequencing of the fliC may be suitable for the identification of antigens by replacing the traditional serology. We studied 17 samples of E. coli isolated from animals and presenting antigen H nontypeable (HNT). The H antigens were characterized by PCR-RFLP and sequencing of fliC gene. Three new flagellin genes were identified, for which specific antisera were obtained. The PCR-RFLP was shown to be faster than the serotyping H antigen in E. coli, provided information on some characteristics of these antigens and indicated the presence of new genes fliC.(AU)
A identificação da Escherichia coli requer conhecimento sobre os sorotipos e fatores de virulência prevalentes permitindo a classificação em patogênico/não patogênico. No entanto, algumas destas bactérias não expressam o antígeno flagelar in vitro. Neste caso, o PCR-restriction fragment length polymorphism (RFLP-PCR) e o sequenciamento do gene fliC podem ser adequados para a identificação desses antígenos, substituindo a sorologia tradicional. Nesta pesquisa foram estudadas 17 amostras de E. coli isoladas de animais e que apresentavam antígeno H não tipável (HNT). Os antígenos H foram caracterizados por PCR-RFLP e sequenciamento do gene fliC. Três novos genes da flagelina foram identificados, para os quais anti-soros específicos foram obtidos. A técnica PCR-RFLP mostrou-se mais rápida que a sorotipagem do antígeno H em E. coli, fornecendo informações sobre algumas características desses antígenos e indicou a presença de novos genes fliC.(AU)
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Animais , Escherichia coli/isolamento & purificação , Flagelina/isolamento & purificação , Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real/veterinária , Polimorfismo de Fragmento de Restrição , Sorotipagem/veterinária , AntígenosRESUMO
Identification of Escherichia coli requires knowledge regarding the prevalent serotypes and virulence factors profiles allows the classification in pathogenic/non-pathogenic. However, some of these bacteria do not express flagellar antigen invitro. In this case the PCR-restriction fragment length polymorphism (RFLP-PCR) and sequencing of the fliC may be suitable for the identification of antigens by replacing the traditional serology. We studied 17 samples of E. coli isolated from animals and presenting antigen H nontypeable (HNT). The H antigens were characterized by PCR-RFLP and sequencing of fliC gene. Three new flagellin genes were identified, for which specific antisera were obtained. The PCR-RFLP was shown to be faster than the serotyping H antigen in E. coli, provided information on some characteristics of these antigens and indicated the presence of new genes fliC.
A identificação da Escherichia coli requer conhecimento sobre os sorotipos e fatores de virulência prevalentes permitindo a classificação em patogênico/não patogênico. No entanto, algumas destas bactérias não expressam o antígeno flagelar in vitro. Neste caso, o PCR-restriction fragment length polymorphism (RFLP-PCR) e o sequenciamento do gene fliC podem ser adequados para a identificação desses antígenos, substituindo a sorologia tradicional. Nesta pesquisa foram estudadas 17 amostras de E. coli isoladas de animais e que apresentavam antígeno H não tipável (HNT). Os antígenos H foram caracterizados por PCR-RFLP e sequenciamento do gene fliC. Três novos genes da flagelina foram identificados, para os quais anti-soros específicos foram obtidos. A técnica PCR-RFLP mostrou-se mais rápida que a sorotipagem do antígeno H em E. coli, fornecendo informações sobre algumas características desses antígenos e indicou a presença de novos genes fliC.
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Animais , Escherichia coli/isolamento & purificação , Flagelina/isolamento & purificação , Polimorfismo de Fragmento de Restrição , Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real/veterinária , Antígenos , Sorotipagem/veterináriaRESUMO
There is a growing interest in enterobacterial flagellins that may result in a demand to produce flagellin on an industrial scale for possible applications as an adjuvant, immunomodulatory agent or vaccine antigen. Traditionally, small-scale production of flagellin has occurred in the laboratory by flagellar shearing of bacterial surfaces and subsequent ultracentrifugation. The main drawback of this method is the need to use low-agitation cultures to avoid the loss of flagella due to shearing during culture. In the present work, we describe a scalable protocol for the production of flagellin with higher yields than traditional laboratory-scale protocols. The use of cross-flow filtration to concentrate bacterial cultures combines extensive shearing of flagella with a reduction in volume, greatly simplifying downstream processing. This technique also allows the use of highly-agitated culture conditions because any sheared flagella are retained in the bacterial concentrate. Flagella obtained with this procedure showed in vivo and in vitro innate activating capacities similar to those of flagella produced at laboratory scale. This procedure is flexible, allowing an increase in production scale, an enhancement of flagellin yield and no requirement for expensive equipment.
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Flagelina/isolamento & purificação , Animais , Técnicas Bacteriológicas , Biotecnologia , Linhagem Celular , Meios de Cultura , Filtração/métodos , Flagelina/imunologia , Humanos , Imunidade Inata , Camundongos , Camundongos Endogâmicos BALB C , Coelhos , Salmonella typhimurium/química , Salmonella typhimurium/imunologiaRESUMO
Flagellin is the structural protein and most abundant component of bacterial flagella. The flagellum filament contains around 20,000 100,000 subunits of 50 kDa flagellin that can have diversebiotechnological applications such as vaccine adjuvant and cellular protector during chemo- and radiotherapy.The main aim of this work was to study a production process of purified native FliC flagellin of Salmonella Typhimurium. The culture conditions in shakers were established with medium devoid of animal-derived components. In bioreactors, culture conditions were established in order to obtain flagellin from the culture supernatant by tangential ultrafiltration (TUF). The concentrated 750 kDa cut-off TUF fraction had a purification factor of 1.5 and a recovery yield of 52.2% for flagellin. The volumetric production of flagellin using the described procedure achieved around 307 mg/L of culture, which represented a significant improvement over previously reported methods. These results permit the development of production and purification processes that can be easily scaled up.
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Flagelina/isolamento & purificação , Reatores Biológicos/microbiologia , Salmonella typhimurium/crescimento & desenvolvimento , Salmonella typhimurium/isolamento & purificação , Fermentação , Ultrafiltração/métodosRESUMO
Salmonellas spp. são bacilos gram-negativos, aeróbio, ou anaeróbios facultativos. A maioria das salmonellas apresenta uma organela de superfície, conhecida como flagelo. O filamento flagelar das salmonellas é composto por cerca de 20.000 subunidades de uma única proteína denominada de flagelina. Em alguns estudos avaliou-se que a flagelina apresenta um efeito imunoestimulador e até mesmo de adjuvante vacinal. Com a crescente demanda e aplicação da flagelina para estes estudos, o grande desafio está em produzir esta proteína em escala possível de ser escalonado assim como estabelecer o processo de purificação da flagelina. O presente trabalho tem como objetivo, estudar as condições de cultivo de Salmonella typhimurium para produção flagelina e estabelecer as etapas de purificação. Ensaios preliminares foram realizados em frascos agitados com peptonas de diferentes origens e marcas, assim como diferentes fontes de carbono para selecionar o componente nutricional mais adequado, e posteriormente foi realizado ensaios em biorreatores para o estabelecimento das condições de cultivo. Paralelamente a purificação da flagelina foi realizada utilizando principalmente a ultrafiltração tangencial. Experimentos realizados em frascos agitados mostraram que a peptona de soja apresentou melhor crescimento celular assim como síntese da flagelina e a presença de glicerol e glicose no meio de cultura afetaram negativamente na sínteseda flagelina. Os resultados dos cultivos em biorreator mostraram que o incrementode tirosina na presença de glicose favoreceu para síntese da flagelina (0, 386 g/L), porém somente o aumento da concentração de meio soytone e de extrato de levedura é resultou na melhor síntese flagelar (1,5 g/L). Quanto à purificação da proteína a flagelina foi purificada a partir do sobrenadante da cultura e ...
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Flagelina , Flagelina/isolamento & purificação , Salmonella typhimuriumRESUMO
A batch of 28 llama (Lama gama) sera from Jujuy province in Argentina was studied in order to identify immune reactive antigens to Leptospira interrogans. Different antigenic preparations from the bacterium were used to study the immune reactivity by the microagglutination (MAT), ELISA and Western immunoblot tests. A control pool of positive bovine sera was used. All the llama sera were negative to MAT as well as to ELISA. Two of the llama sera and the positive bovine sera pool rendered positive results when evaluated by Western immunoblot, allowing the identification of immune reactive proteins. These proteins were identified by MALDI-TOF. A periplasmic flagellin of Leptospira interrogans serovar Lai STR called FlaB1 was identified from the reactive llama sera, and an external membrane lipoprotein of Leptospira interrogans serovar Ballum called LipL21 was identified from the pool of bovine positive sera. These proteins could be used in a new ELISA applied to the early diagnosis of leptospirosis in different kind of cattle or wild reservoirs.
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Anticorpos Antibacterianos/imunologia , Antígenos de Bactérias/imunologia , Proteínas da Membrana Bacteriana Externa/imunologia , Proteínas de Bactérias/imunologia , Camelídeos Americanos/imunologia , Epitopos/imunologia , Flagelina/imunologia , Leptospira interrogans/imunologia , Leptospirose/veterinária , Lipoproteínas/imunologia , Animais , Antígenos de Bactérias/isolamento & purificação , Argentina/epidemiologia , Proteínas da Membrana Bacteriana Externa/isolamento & purificação , Proteínas de Bactérias/isolamento & purificação , Western Blotting , Camelídeos Americanos/sangue , Bovinos , Ensaio de Imunoadsorção Enzimática , Epitopos/isolamento & purificação , Flagelina/isolamento & purificação , Leptospirose/epidemiologia , Leptospirose/imunologia , Lipoproteínas/isolamento & purificação , Testes Sorológicos/veterinária , Espectrometria de Massas por Ionização e Dessorção a Laser Assistida por MatrizRESUMO
Se estudió un lote de 28 sueros de llama (Lama gama) de la provincia de Jujuy, Argentina, a fin de identificar antígenos inmunorreactivos contra Leptospira interrogans. Se utilizaron distintas preparaciones antigénicas de la bacteria para estudiar la inmunorreactividad mediante microaglutinación (MAT), ELISA y Western inmunoblot. Un pool de sueros bovinos positivos a la MAT fue empleado como control. Todos los sueros de llama fueron negativos mediante MAT e igual resultado se observó mediante ELISA. Dos de los 28 sueros de llama y el pool de sueros bovinos positivos, al ser evaluados por Western inmunoblot, arrojaron resultados positivos y permitieron identificar proteínas inmunorreactivas. Por MALDI-TOF se logró establecer que la proteína asociada a los dos sueros de llama inmunorreactivos era una flagelina periplásmica de Leptospira interrogans serovar Lai STR, mientras que la asociada al pool de sueros bovinos positivos a Leptospira sp. se trataba de una lipoproteína de la membrana externa de Leptospira interrogans serovar Ballum, LipL21. Estas proteínas podrían ser utilizadas en el diseño de un nuevo ELISA aplicado al diagnóstico temprano de leptospirosis, ya sea en distintos tipos de ganado como así también en reservorios silvestres.
A batch of 28 llama (Lama gama) sera from Jujuy province in Argentina was studied in order to identify immune reactive antigens to Leptospira interrogans. Different antigenic preparations from the bacterium were used to study the immune reactivity by the microagglutinattion (MAT), ELISA and Western immunoblot tests. A control pool of positive bovine sera was used. All the llama sera were negative to MAT as well as to ELISA. Two of the llama sera and the positive bovine sera pool rendered positive results when evaluated by Western immunoblot, allowing the identification of immune reactive proteins. These proteins were identified by MALDI-TOF. A periplasmic flagellin of Leptospira interrogans serovar Lai STR called FlaB1 was identified from the reactive llama sera, and an external membrane lipoprotein of Leptospira interrogans serovar Ballum called LipL21 was identified from the pool of bovine positive sera. These proteins could be used in a new ELISA applied to the early diagnosis of leptospirosis in different kind of cattle or wild reservoirs.
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Animais , Bovinos , Anticorpos Antibacterianos/imunologia , Antígenos de Bactérias/imunologia , Proteínas da Membrana Bacteriana Externa/imunologia , Proteínas de Bactérias/imunologia , Camelídeos Americanos/imunologia , Epitopos/imunologia , Flagelina/imunologia , Leptospira interrogans/imunologia , Leptospirose/veterinária , Lipoproteínas/imunologia , Antígenos de Bactérias/isolamento & purificação , Argentina/epidemiologia , Western Blotting , Proteínas da Membrana Bacteriana Externa/isolamento & purificação , Proteínas de Bactérias/isolamento & purificação , Camelídeos Americanos/sangue , Ensaio de Imunoadsorção Enzimática , Epitopos/isolamento & purificação , Flagelina/isolamento & purificação , Leptospirose/epidemiologia , Leptospirose/imunologia , Lipoproteínas/isolamento & purificação , Espectrometria de Massas por Ionização e Dessorção a Laser Assistida por Matriz , Testes Sorológicos/veterináriaRESUMO
The present study evaluated the immunogenicity of new malaria vaccine formulations based on the 19kDa C-terminal fragment of Plasmodium vivax Merozoite Surface Protein-1 (MSP1(19)) and the Salmonella enterica serovar Typhimurium flagellin (FliC), a Toll-like receptor 5 (TLR5) agonist. FliC was used as an adjuvant either admixed or genetically linked to the P. vivax MSP1(19) and administered to C57BL/6 mice via parenteral (s.c.) or mucosal (i.n.) routes. The recombinant fusion protein preserved MSP1(19) epitopes recognized by sera collected from P. vivax infected humans and TLR5 agonist activity. Mice parenterally immunized with recombinant P. vivax MSP1(19) in the presence of FliC, either admixed or genetically linked, elicited strong and long-lasting MSP1(19)-specific systemic antibody responses with a prevailing IgG1 subclass response. Incorporation of another TLR agonist, CpG ODN 1826, resulted in a more balanced response, as evaluated by the IgG1/IgG2c ratio, and higher cell-mediated immune response measured by interferon-gamma secretion. Finally, we show that MSP1(19)-specific antibodies recognized the native protein expressed on the surface of P. vivax parasites harvested from infected humans. The present report proposes a new class of malaria vaccine formulation based on the use of malarial antigens and the innate immunity agonist FliC. It contains intrinsic adjuvant properties and enhanced ability to induce specific humoral and cellular immune responses when administered alone or in combination with other adjuvants.
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Adjuvantes Imunológicos , Flagelina/farmacologia , Vacinas Antimaláricas/imunologia , Proteína 1 de Superfície de Merozoito/imunologia , Plasmodium vivax/imunologia , Salmonella typhimurium/metabolismo , Receptor 5 Toll-Like/agonistas , Administração Intranasal , Animais , Anticorpos Monoclonais/biossíntese , Anticorpos Monoclonais/imunologia , Química Farmacêutica , Feminino , Flagelina/isolamento & purificação , Técnica Indireta de Fluorescência para Anticorpo , Esquemas de Imunização , Injeções Subcutâneas , Vacinas Antimaláricas/administração & dosagem , Vacinas Antimaláricas/genética , Proteína 1 de Superfície de Merozoito/genética , Camundongos , Camundongos Endogâmicos C57BL , Plasmodium vivax/genética , Células Th1/imunologia , Células Th2/imunologia , Vacinas Sintéticas/imunologiaRESUMO
Bacterial flagellins are important virulence-associated factors and strong inducers of inflammatory responses in mammalian hosts. Flagellins have also been investigated as potential vaccine adjuvants, either for induction of humoral or cellular immune responses, to different target antigens. In this study we investigated the adjuvant properties of three Salmonella enterica flagellins types (FliCd, FliCi and FljB) to an ovalbumin-derived CD8+ T cell-restricted epitope (OVA257264). Although mice immunized with the three tested flagellins elicited antigen-specific activated CD8+ T cells, only animals immunized with FliCi and FliCd flagellins admixed with ovalbumin mounted specific in vivo cytotoxic responses to peptide-pulsed target cells. The present results indicate that Salmonella flagellins are endowed with type-specific adjuvant effects toward murine CD8+ T cells, a feature that may impact their use as adjuvants for prophylatic or therapeutic vaccines.
As flagelinas bacterianas são importantes fatores associados à virulência e potentes indutores de resposta inflamatória em mamíferos. Estas moléculas são também investigadas como potencial adjuvante para uso em vacinas na indução de resposta imune humoral e celular para diferentes antígenos alvo. No presente estudo investigamos as propriedades adjuvantes de três tipos de flagelinas de Salmonella enterica (FliCd, FliCi e FljB) para um epítopo derivado da ovalbumina específico para células T CD8+. As três flagelinas testadas induziram respostas de células T CD8+ específicas em camundongos imunizados, porém, somente animais imunizados com as flagelinas FliCi e FliCd co-administradas com ovalbumina montaram resposta citotóxica específica in vivo para células-alvo pulsadas com peptídeo OVA. Os resultados apresentados indicam que flagelinas de Salmonella são dotadas de efeitos adjuvantes tipo-específico frente a células T CD8+ in vivo, uma característica que pode gerar impactos no uso dessas proteínas como adjuvantes em vacinas profiláticas ou terapêuticas.
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Animais , Adjuvantes Imunológicos , Flagelina/análise , Flagelina/isolamento & purificação , Técnicas In Vitro , Linfócitos T , Salmonella enterica/isolamento & purificação , Vacinas/análise , Métodos , VirulênciaRESUMO
The bvg or vir locus positively regulates the expression of many Bordetella virulence-associated determinants (encoded by vag genes), including cell envelope proteins, in response to environmental stimuli. On the other hand, several genes named vrg genes are negatively controlled by the bvg regulon (Knapp and Mekalanos, 1988). Flagellin is encoded by a vrg gene, which is expressed when the principal virulence factors are eliminated during antigenic modulation or in phase variants (Akerley et al., 1992). We have previously analyzed SDS-PAGE profiles of Sarkosyl-outer membrane protein (OMP)-enriched fractions from B. bronchiseptica Bvg- and modulated Bvg+ strains and reported a major band associated with the avirulent phenotype (Passerini de Rossi et al., 1995). In order to characterize this band we have purified flagellar filaments from Bvg- and modulated Bvg+ strains, and analyzed them by SDS-PAGE. These profiles revealed a single major band of 40 or 45 kDa depending on the strain. The N-terminal amino acid sequence of the putative flagellin expressed by BB7200a was identical over the first 21 residues analyzed to that of the flagellin from the modulated strain BB7865 reported by Akerley et al. (1992). Comparison of the SDS-PAGE profile of flagellar filaments with that of the OMP-enriched fraction of the corresponding strain showed that the flagellum-associated polypeptide had the same electrophoretic mobility as that of the characteristic band of the avirulent phenotype. Furthermore, this band was absent in the OMP-enriched fraction profile from a Bvg- strain subjected to a treatment that removes flagella. Our results indicate that the major protein observed in SDS-PAGE profiles of Sarkosyl-OMP-enriched fractions from B. bronchiseptica Bvg- and modulated Bvg+ strains corresponds to flagellin.