RESUMO
Inosine monophosphate dehydrogenase (IMPDH) catalyzes the rate-limiting step in de novo guanine nucleotide biosynthesis. Its activity is negatively regulated by the binding of GTP. IMPDH can form a membraneless subcellular structure termed the cytoophidium in response to certain changes in the metabolic status of the cell. The polymeric form of IMPDH, which is the subunit of the cytoophidium, has been shown to be more resistant to the inhibition by GTP at physiological concentrations, implying a functional correlation between cytoophidium formation and the upregulation of GTP biosynthesis. Herein we demonstrate that zebrafish IMPDH1b and IMPDH2 isoforms can assemble abundant cytoophidium in most of cultured cells under stimuli, while zebrafish IMPDH1a shows distinctive properties of forming the cytoophidium in different cell types. Point mutations that disrupt cytoophidium structure in mammalian models also prevent the aggregation of zebrafish IMPDHs. In addition, we discover the presence of the IMPDH cytoophidium in various tissues of larval and adult fish under normal growth conditions. Our results reveal that polymerization and cytoophidium assembly of IMPDH can be a regulatory machinery conserved among vertebrates, and with specific physiological purposes.
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Estruturas Citoplasmáticas/ultraestrutura , IMP Desidrogenase/química , Proteínas de Peixe-Zebra/química , Peixe-Zebra/metabolismo , Animais , Linhagem Celular , Estruturas Citoplasmáticas/química , Expressão Gênica , Guanosina Trifosfato/biossíntese , Guanosina Trifosfato/metabolismo , Humanos , IMP Desidrogenase/genética , IMP Desidrogenase/metabolismo , Isoenzimas/química , Isoenzimas/genética , Mutação Puntual , Regulação para Cima , Peixe-Zebra/crescimento & desenvolvimento , Proteínas de Peixe-Zebra/genética , Proteínas de Peixe-Zebra/metabolismoRESUMO
A produção in vitro de embriões suínos tem alcançado resultados insatisfatórios: ovócitos maturados in vivo produzem uma porcentagem maior de embriões em relação aos maturados in vitro. O sucesso da maturação in vitro está diretamente relacionado com a competência ovocitária. Somente ovócitos competentes são capazes de serem fecundados e terem desenvolvimento embrionário normal. A competência ovocitária pode ser avaliada por vários parâmetros. Recentemente têm sido utilizados como parâmetro os estudos da expressão de genes associados com a competência. O presente trabalho teve por objetivo avaliar diferenças na expressão dos genes BMP15, RYBP, MATER e ZAR1 em ovócitos imaturos de diferentes classes morfológicas, sendo elas: 1, 2, 3 e 4, com a finalidade de proporcionar importantes marcadores moleculares relacionados com a capacidade ovocitária. O RNA total dos ovócitos foi extraído e utilizado como molde para a síntese da primeira fita de cDNA. Os resultados da expressão gênica foram analisados utilizando-se modelo misto, considerando os dados de expressão gênica variável dependente e as classes ovocitárias variáveis independentes. Os genes BMP15, ZAR1 e RYBP apresentaram expressão semelhante nas classes ovocitárias 1, 2 e 3; somente a categoria 4 diferiu na expressão desses genes (P<0,05). O gene MATER foi expresso de forma semelhante em todas as classes ovocitárias estudadas (P>0,05). A técnica de RT-qPCR foi eficiente para detecção desses transcritos em ovócitos de diferentes classes. No entanto, para melhor entendimento do envolvimento desses transcritos na aquisição da competência ovocitária, são necessários mais estudos avaliando ovócitos de diferentes classes morfológicas, em diferentes fases de desenvolvimento, e implicação de outros genes envolvidos com a competência ovocitária.
The in vitro production of pig embryos has achieved unsatisfactory results; in vivo matured oocytes produce a higher percentage of embryos compared to in vitro maturation. The success of in vitro maturation is directly related to oocyte competence. Only competent oocytes are capable of being fertilized and have normal embryonic development. The oocyte competence can be assessed using several parameters. Recently these parameters have been used for gene expression studies associated with competence. This work aimed to evaluate differences in gene expression BMP15, RYBP, MATER, ZAR1 as endogenous control and the constitutive gene GAPDH in immature oocytes of different morphological classes which are: 1, 2, 3 and 4, in order to provide significant molecular markers linked to the ability of development. Oocytes Total RNA was extracted and used as a template for synthesis of the first cDNA strand. The results of gene expression were analyzed using a mixed model, considering the dependent gene expression data and independent ovocitary variable classes. The genes BMP15, RYBP ZAR1 and showed similar ovocitary expression in classes 1, 2 and 3 differ only in category 4 in their expression (P<0.05). The MATER gene was similarly expressed in all ovocitary classes studied (P>0.05). The RTQ-PCR technique was effective for detection of these transcripts in oocytes from different classes. However, for better understanding of the involvement of these transcripts in the acquisition of oocyte competence more studies are needed to evaluate different morphological classes of oocytes at different stages of development and the implication of other genes involved in oocyte competence.
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Animais , Desenvolvimento Embrionário , Expressão Gênica , Suínos/embriologia , Técnicas de Maturação in Vitro de Oócitos/estatística & dados numéricos , Técnicas de Maturação in Vitro de Oócitos/veterinária , Estruturas Citoplasmáticas , Fertilização in vitro/veterinária , OócitosRESUMO
A produção in vitro de embriões suínos tem alcançado resultados insatisfatórios: ovócitos maturados in vivo produzem uma porcentagem maior de embriões em relação aos maturados in vitro. O sucesso da maturação in vitro está diretamente relacionado com a competência ovocitária. Somente ovócitos competentes são capazes de serem fecundados e terem desenvolvimento embrionário normal. A competência ovocitária pode ser avaliada por vários parâmetros. Recentemente têm sido utilizados como parâmetro os estudos da expressão de genes associados com a competência. O presente trabalho teve por objetivo avaliar diferenças na expressão dos genes BMP15, RYBP, MATER e ZAR1 em ovócitos imaturos de diferentes classes morfológicas, sendo elas: 1, 2, 3 e 4, com a finalidade de proporcionar importantes marcadores moleculares relacionados com a capacidade ovocitária. O RNA total dos ovócitos foi extraído e utilizado como molde para a síntese da primeira fita de cDNA. Os resultados da expressão gênica foram analisados utilizando-se modelo misto, considerando os dados de expressão gênica variável dependente e as classes ovocitárias variáveis independentes. Os genes BMP15, ZAR1 e RYBP apresentaram expressão semelhante nas classes ovocitárias 1, 2 e 3; somente a categoria 4 diferiu na expressão desses genes (P<0,05). O gene MATER foi expresso de forma semelhante em todas as classes ovocitárias estudadas (P>0,05). A técnica de RT-qPCR foi eficiente para detecção desses transcritos em ovócitos de diferentes classes. No entanto, para melhor entendimento do envolvimento desses transcritos na aquisição da competência ovocitária, são necessários mais estudos avaliando ovócitos de diferentes classes morfológicas, em diferentes fases de desenvolvimento, e implicação de outros genes envolvidos com a competência ovocitária.(AU)
The in vitro production of pig embryos has achieved unsatisfactory results; in vivo matured oocytes produce a higher percentage of embryos compared to in vitro maturation. The success of in vitro maturation is directly related to oocyte competence. Only competent oocytes are capable of being fertilized and have normal embryonic development. The oocyte competence can be assessed using several parameters. Recently these parameters have been used for gene expression studies associated with competence. This work aimed to evaluate differences in gene expression BMP15, RYBP, MATER, ZAR1 as endogenous control and the constitutive gene GAPDH in immature oocytes of different morphological classes which are: 1, 2, 3 and 4, in order to provide significant molecular markers linked to the ability of development. Oocytes Total RNA was extracted and used as a template for synthesis of the first cDNA strand. The results of gene expression were analyzed using a mixed model, considering the dependent gene expression data and independent ovocitary variable classes. The genes BMP15, RYBP ZAR1 and showed similar ovocitary expression in classes 1, 2 and 3 differ only in category 4 in their expression (P<0.05). The MATER gene was similarly expressed in all ovocitary classes studied (P>0.05). The RTQ-PCR technique was effective for detection of these transcripts in oocytes from different classes. However, for better understanding of the involvement of these transcripts in the acquisition of oocyte competence more studies are needed to evaluate different morphological classes of oocytes at different stages of development and the implication of other genes involved in oocyte competence.(AU)
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Animais , Suínos/embriologia , Expressão Gênica , Técnicas de Maturação in Vitro de Oócitos/estatística & dados numéricos , Técnicas de Maturação in Vitro de Oócitos/veterinária , Desenvolvimento Embrionário , Oócitos , Fertilização in vitro/veterinária , Estruturas CitoplasmáticasRESUMO
Sperm morphology of the parasitoid Muscidifurax uniraptor was investigated under light and transmission electron microscopy. M. uniraptor sperm are filiform, spiraled, approximately 150 µm in length, with a distinctive head, hooded by an extracellular sheath and a flagellum. This extracellular layer, from which many filaments radiate, measures approximately 90 nm in thickness and covers a small acrosome and the anterior nuclear region. The acrosome is composed of an acrosomal vesicle and a perforatorium with its base inserted in the nuclear tip. The nucleus is filled with homogeneously compacted chromatin. The centriolar adjunct extends towards the anterior portion in a spiral around the nucleus for 3.5 µm in length. The two mitochondrial derivatives begin exactly at the centriole adjunct base and, in cross-section, have a circular shape with equal areas that are smaller than the axoneme diameter. It is coiled, with 9 + 9 + 2 microtubules and begins from the centriole, just below the nuclear base. The axoneme is connected to the mitochondrial derivatives by two small irregularly shaped masses. Between the derivatives and the axoneme, the 'center-flagellar material' is observed. Overall, these characteristics are recognized in other Chalcidoidea, especially in the eurytomids, but together they form a set of species-specific data.
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Espermatozoides/ultraestrutura , Vespas/ultraestrutura , Animais , Estruturas Citoplasmáticas/ultraestrutura , Masculino , Microscopia Eletrônica de Transmissão , Especificidade da Espécie , Vespas/citologiaRESUMO
Stress granules (SGs) and P-bodies (PBs) are related cytoplasmic structures harboring silenced mRNAs. SGs assemble transiently upon cellular stress, whereas PBs are constitutive and are further induced by stress. Both foci are highly dynamic, with messenger ribonucleoproteins (mRNPs) and proteins rapidly shuttling in and out. Here, we show that impairment of retrograde transport by knockdown of mammalian dynein heavy chain 1 (DHC1) or bicaudal D1 (BicD1) inhibits SG formation and PB growth upon stress, without affecting protein-synthesis blockage. Conversely, impairment of anterograde transport by knockdown of kinesin-1 heavy chain (KIF5B) or kinesin light chain 1 (KLC1) delayed SG dissolution. Strikingly, SG dissolution is not required to restore translation. Simultaneous knockdown of dynein and kinesin reverted the effect of single knockdowns on both SGs and PBs, suggesting that a balance between opposing movements driven by these molecular motors governs foci formation and dissolution. Finally, we found that regulation of SG dynamics by dynein and kinesin is conserved in Drosophila.
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Estruturas Citoplasmáticas/metabolismo , Dineínas/metabolismo , Cinesinas/metabolismo , Proteínas Associadas aos Microtúbulos/metabolismo , Animais , Estruturas Citoplasmáticas/genética , Proteínas de Drosophila , Dineínas/genética , Cinesinas/genética , Camundongos , Proteínas Associadas aos Microtúbulos/genética , Células NIH 3T3 , Biossíntese de ProteínasRESUMO
Em tripanossomatídeos a regulação da expressão gênica ocorre principalmente em nível pós-transcricional por mecanismos que envolvem mudanças na estabilidade e no acesso dos mRNAs aos polissomos. Estes mecanismos permitem uma rápida adaptação destes parasitas a diferentes condições as quais são expostos durante o ciclo de vida. Estudos recentes têm demonstrado que grânulos de mRNA, presentes em diversos eucariotos têm papel fundamental na regulação da expressão gênica em nível pós-transcricional. Estes grânulos são divididos em diferentes classes (entre elas os P-bodies e os grânulos de estresse), contém mRNPs não comprometidas com a tradução, compartilham algumas proteínas e podem utilizar mecanismos semelhantes para regular o metabolismo de mRNAs. Os P-bodies são sítios de estocagem e/ou degradação de mRNAs, enquanto os grânulos de estresse estão envolvidos na triagem e estocagem de diversos transcritos. Como existe evidência de que moléculas de mRNA podem ser mantidas estáveis e não associadas à polissomos em T. cruzi, nós conjecturamos a possibilidade de que estas estruturas estejam presentes e sejam funcionais neste parasita. Os genes que codificam alguns componentes de P-bodies estão presentes em T. cruzi e embora algumas proteínas que constituem o cerne destas estruturas pareçam estar ausentes neste parasita, a maioria das funções inerentes aos P-bodies estão representadas. Nós identificamos e clonamos a proteína TcDhh1, uma DEAD box RNA helicase altamente conservada entre os eucariotos e considerada marcadora de P-bodies em mamíferos e leveduras. Esta proteína é constitutivamente expressa durante todo o ciclo de vida do parasita, está presente em complexos independentes de polissomos e está localizada em foci citoplasmáticos que variam em número quando as células são submetidas a condições de estresse ou ao tratamento com as drogas cicloheximida e puromicina. Para determinar a composição destes grânulos, nós realizamos ensaios de...
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Estruturas Citoplasmáticas , Regulação da Expressão Gênica , Polirribossomos , RNA , Trypanosoma cruziRESUMO
Gene expression in trypanosomatids is mainly regulated post-transcriptionally. One of the mechanisms involves the differential stability of mRNAs. However, the existence of other mechanisms involving the accessibility of mRNAs to the translation machinery cannot be ruled out. Defined cytoplasmic foci containing non-translating mRNPs, known as P-bodies, have been discovered in recent years. P-bodies are sites where mRNA can be decapped and 5'-3' degraded or stored for subsequent return to polysomes. The highly conserved DEAD box helicase Dhh1p is a marker protein of P-body functions. Here, we report the identification and cloning of a Trypanosoma cruzi Dhh1 homolog gene. TcDhh1 expression is not regulated through the parasite life cycle or under stress conditions. We show that TcDhh1 is present in polysome-independent complexes and is localized to discrete cytoplasmic foci, resembling P-bodies; these foci vary in number according to nutritional stress conditions and cycloheximide/puromycin treatment.
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Estruturas Citoplasmáticas/metabolismo , RNA Helicases DEAD-box/metabolismo , Regulação da Expressão Gênica no Desenvolvimento/fisiologia , Proteínas de Saccharomyces cerevisiae/metabolismo , Trypanosoma cruzi/crescimento & desenvolvimento , Trypanosoma cruzi/metabolismo , Animais , Células Cultivadas , RNA Mensageiro Estocado/metabolismoRESUMO
Surgical biopsies of frontal, parietal and temporal regions of thirty two patients with clinical diagnosis of congenital hydrocephalus, brain trauma, tumours, and vascular anomalies were examined with the transmission electron microscope. The main goal was to study the submicroscopic alterations of somatodendritic, axonal, and synaptic plasma membranes, cytomembranes, and the cytoskeleton. In both, moderate and severe oedema, fragmentation of plasma membrane, enlargement and focal necrosis of rough endoplasmic cisterns and nuclear envelope, detachment of membrane-bound ribosomes and reduction of polysome were observed. The degenerated myelinated axons exhibited discontinuities of the axolemma, disorganisation of multiple myelin lamellae, myelin sheath vacuolization, and formation of myelin ovoids. In severe oedema, synaptic disassembly was frequently found characterized by separate pre- and postsynaptic endings and loss of perisynaptic glial ensheathment. Fragmented and intact microtubules and actin-like filaments also were distinguished. The alterations of plasma membranes and cytomembranes are related with the anoxic-ischaemic conditions of brain parenchyma. The role of free radical and lipid peroxidation, disturbed energy metabolism, altered metabolic cascades, excitotoxicity, protein aggregation, and presence of extracellular oedema fluid is discussed in relation with the derangement of neuronal membranes.
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Edema Encefálico/patologia , Membrana Celular/ultraestrutura , Córtex Cerebral/patologia , Microscopia Eletrônica de Transmissão , Neurônios/ultraestrutura , Adolescente , Adulto , Idoso , Idoso de 80 Anos ou mais , Encéfalo/irrigação sanguínea , Edema Encefálico/etiologia , Lesões Encefálicas/patologia , Neoplasias Encefálicas/patologia , Malformações Vasculares do Sistema Nervoso Central/patologia , Criança , Pré-Escolar , Estruturas Citoplasmáticas/ultraestrutura , Feminino , Humanos , Hidrocefalia/patologia , Lactente , Recém-Nascido , Masculino , Pessoa de Meia-IdadeRESUMO
Larval haemocytes of Anticarsia gemmatalis (Lepidoptera: Noctuidae) are presented and classified based on morphological characteristics. Haemolymph samples collected from 3rd to 6th instar larvae were observed using differential interference contrast microscopy as well as processed for transmission and scanning electron microscopy. Five general types of haemocytes were observed: prohaemocytes (Pr), plasmatocytes (Pl), granular haemocytes (GH), oenocytoids (Oe) and spherulocytes (SPh). Granular haemocytes were subdivided into two morphologically different subtypes (GH 1 and GH 2). Phenoloxidase activity was clearly observed in the Oe, and also less intensely in the Sph. The osmium/imidazole buffer technique revealed that GH 2 accumulated numerous, small lipid vesicles among their granules, while Pl contained larger but less numerous lipid inclusions. Total haemocyte counts varied between 12.3 and 20.9 x 10(3) haemocytes/microl. Pl, GH 1 and Sph were the cell types more frequently observed in all larval stages studied. GH 2 were rare in 3rd and 4th instars, becoming more numerous after the inception of the 5th instar. Populations of GH 1 and Sph maintained their proportions throughout larval development. Populations of Oe, Pl and Pr, however, presented more marked variations in their proportions. Ultrastructural studies were shown to be useful for the identification and classification of haemocytes, facilitating further analysis by light microscopy.
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Hemócitos/ultraestrutura , Hemolinfa/citologia , Larva/ultraestrutura , Lepidópteros/citologia , Animais , Estruturas Citoplasmáticas/ultraestrutura , Hemócitos/enzimologia , Larva/crescimento & desenvolvimento , Lepidópteros/crescimento & desenvolvimento , Microscopia Eletrônica de Varredura , Monofenol Mono-Oxigenase/metabolismoRESUMO
Pathologic changes induced in the small intestine of suckling mice by rotavirus infection were studied by conventional histology, immunofluorescence, scanning electron microscopy, and electron microscopy of ultrathin sections. Infection could be detected within 24 hours in a few mice, but after 2 days it was well established. Swollen, often vacuolated infected cells were found on the sides and tips of villi from which they rapidly became detached; microvilli showed variable irregularity. Immature enterocytes from crypts replaced lost infected cells. By the tenth day very few infected cells could still be found. Both tubular structures and spherical particles occurred in the infected cells. Only tubular structures were found in nuclei.