RESUMO
In this paper we report the development of a recombinant strain of the yeast Pichia pastoris, which secretes an anti-carcinoembryonic antigen single chain Fv (scFv) antibody fragment to the culture supernatant as a biologically active protein, at levels of 1.2 g l(-1). The yeast scFv was purified by IMAC, with a final yield of approximately 0.440 g of 93% pure scFv per liter of culture supernatant. The specific activity in ELISA of the yeast scFv was almost three times higher than that of a bacterial periplasmic counterpart. These results reaffirm that the yeast P. pastoris is a suitable host for high level production of scFv antibody fragments with potential in vivo diagnostic and therapeutic applications.
Assuntos
Adenosina Trifosfatases , Antígeno Carcinoembrionário/biossíntese , Antígeno Carcinoembrionário/genética , Proteínas de Ligação a DNA , Proteínas de Escherichia coli , Fragmentos de Imunoglobulinas/biossíntese , Fragmentos de Imunoglobulinas/genética , Pichia/metabolismo , Proteínas Recombinantes/biossíntese , Animais , Proteínas de Bactérias/genética , Proteínas de Bactérias/metabolismo , Biotecnologia/métodos , Antígeno Carcinoembrionário/isolamento & purificação , Cromatografia de Afinidade , Ensaio de Imunoadsorção Enzimática , Fermentação , Regulação Fúngica da Expressão Gênica , Fragmentos de Imunoglobulinas/isolamento & purificação , Região Variável de Imunoglobulina/biossíntese , Região Variável de Imunoglobulina/genética , Região Variável de Imunoglobulina/isolamento & purificação , Camundongos , Proteína MutS de Ligação de DNA com Erro de Pareamento , Pichia/genética , Engenharia de Proteínas/métodos , Proteínas Recombinantes/genética , Proteínas Recombinantes/isolamento & purificação , Transformação GenéticaRESUMO
The aim of this work was to assess the diagnostic yield of serum tumoral markers, Ca 19-9 and carcinoembryonic antigen, in patients with gallbladder cancer. We studied 54 patients of whom 33 had gallbladder cancer and in 21 the tumor was removed previously and were presently free of disease. Twenty one patients with cholelithiasis were used as controls. Ca 19-9 was over 37 U/ml in 22 (65 percent) patients with cancer, in two patients free of disease and two controls. The sensitivity and specificity of Ca 19-9 was 0.66 and 0.90 respectively. Carcinoembryonic antigen was over 2.5 ng/ml in 25 patients with cancer (56 percent) and in sensitivity and specificity was 0.75 and 0.71 respectively. Using a cutoff point of 4 ng/ml, these figures were 0.51 and 0.9 respectively. The better predictive capacity was given by Ca 19-9 over 37 U/ml or a carcinoembryonic antigen over 4 ng/ml. It is concluded that, although the sensitivity and specificity of these markers was adequate in this work, one must hear in mind that studied patients had advanced tumors
Assuntos
Humanos , Masculino , Feminino , Adulto , Pessoa de Meia-Idade , Neoplasias da Vesícula Biliar/imunologia , /isolamento & purificação , Estudos de Casos e Controles , Sensibilidade e Especificidade , Reações Falso-Negativas , Antígeno Carcinoembrionário/isolamento & purificação , Biomarcadores Tumorais/isolamento & purificaçãoRESUMO
Se determina CEA (antígeno carcinoembrionario) en plasma de 196 voluntarios, aparentemente sanos, encuestados en cuanto a edad, sexo, raza, hábito tabáquico y uso o no de fogón (costumbre mapuche). Se demuestra diferencia estadísticamente significativa en cuanto a: 1) aumento de los títulos en las edades mayores, independientes del sexo, raza y hábito tabáquico y 2) aumento de los títulos en los (F) fumadores, en relación a los (NF) no fumadores, independientes del sexo y raza. Se construye nomograma de distribución, con ecuación de regresión + 2SD para F y NF, delimitándose un 95% de posibilidades de pertenecer al área de normalidad en una curva de distribución normal, como primera fase en la implementación de la técnica en la IX región, Chile
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Adulto , Pessoa de Meia-Idade , Humanos , Masculino , Feminino , Antígeno Carcinoembrionário/isolamento & purificação , Fatores Etários , Indígenas Sul-Americanos , Fatores SexuaisRESUMO
El objetivo del presente trabajo fue la producción, caracterización y aplicación de anticuerpos monoclonales anti-antígeno carcinoembrionario. Ratones Balb/c fueron inmunizados con 2 dosis ip de 5 y 10 microng de antígeno carcinoembrionario en adyuvante completo de Freund cada 30 días, y 3 dosis de refuerzo durante días consecutivos. Las células esplénicas fueron fusionadas con células de mieloma X63/Ag8.653 en presencia de polietilenglicol, y los híbridos rescatados en medio selectivo conteniendo hipoxantina-methotrexate-timidina. La detección de híbridos productores de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno se realizó por radioinmunoanálisis en fase sólida, utilizando como trazador imunoglobulina de conejo anti-ratón marcada con 125I. Se obtuvo una eficiencia del 65% en crescimiento y del 13% en positividad. Los híbridos fueron clonados y estabilizados por miniclonado repetitivo, con un 65% de crecimiento y 40% de positividad. De 11 hibridomas productores se seleccionaron 3 que fueron inyectados en ratones BALB/c para la obtención de tumores ascíticos. La inmuno-especificidad de los anticuerpos monoclonales A4, A15 y A19 fue determinada por inmunoelectroforesis crozada, detectándose la formación de inmunoprecipitados específicos entre los anticuerpos monoclonales y el antígeno carcinoembrionario marcado con 125I. El anticuerpo monoclonal A4, de altas afinidad (K=1,60x10*10 litros/mol) fue activo en el radioinmunoensayo hasta la dilución 1: 10 000 testada, permitiendo detectar valores de aproximadamente 0,5ng/ml. En ensayos de competición contra el anticuerpo policlonal, el rango de inhibición obtenido fue del 28 al 35% utilizando antígeno purificado, y del 10 al 15% con sueros de pacientes afectados por cáncer de colon...
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Camundongos , Animais , Humanos , Feminino , Anticorpos Monoclonais/biossíntese , Especificidade de Anticorpos/métodos , Antígeno Carcinoembrionário/isolamento & purificação , Hibridização Genética , Hibridomas/imunologia , Técnicas In Vitro , Anticorpos Monoclonais/isolamento & purificação , Técnicas de Cultura , Hibridomas/transplante , Camundongos Endogâmicos BALB CRESUMO
El objetivo del presente trabajo fue la producción, caracterización y aplicación de anticuerpos monoclonales anti-antígeno carcinoembrionario. Ratones Balb/c fueron inmunizados con 2 dosis ip de 5 y 10 microng de antígeno carcinoembrionario en adyuvante completo de Freund cada 30 días, y 3 dosis de refuerzo durante días consecutivos. Las células esplénicas fueron fusionadas con células de mieloma X63/Ag8.653 en presencia de polietilenglicol, y los híbridos rescatados en medio selectivo conteniendo hipoxantina-methotrexate-timidina. La detección de híbridos productores de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno se realizó por radioinmunoanálisis en fase sólida, utilizando como trazador imunoglobulina de conejo anti-ratón marcada con 125I. Se obtuvo una eficiencia del 65% en crescimiento y del 13% en positividad. Los híbridos fueron clonados y estabilizados por miniclonado repetitivo, con un 65% de crecimiento y 40% de positividad. De 11 hibridomas productores se seleccionaron 3 que fueron inyectados en ratones BALB/c para la obtención de tumores ascíticos. La inmuno-especificidad de los anticuerpos monoclonales A4, A15 y A19 fue determinada por inmunoelectroforesis crozada, detectándose la formación de inmunoprecipitados específicos entre los anticuerpos monoclonales y el antígeno carcinoembrionario marcado con 125I. El anticuerpo monoclonal A4, de altas afinidad (K=1,60x10*10 litros/mol) fue activo en el radioinmunoensayo hasta la dilución 1: 10 000 testada, permitiendo detectar valores de aproximadamente 0,5ng/ml. En ensayos de competición contra el anticuerpo policlonal, el rango de inhibición obtenido fue del 28 al 35% utilizando antígeno purificado, y del 10 al 15% con sueros de pacientes afectados por cáncer de colon...(AU)
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Camundongos , Animais , Humanos , Feminino , Técnicas In Vitro , Anticorpos Monoclonais/biossíntese , Antígeno Carcinoembrionário/isolamento & purificação , Especificidade de Anticorpos/métodos , Hibridização Genética , Hibridomas/imunologia , Anticorpos Monoclonais/isolamento & purificação , Técnicas de Cultura , Hibridomas , Camundongos Endogâmicos BALB CRESUMO
Se aisló y purificó antígeno carcinoembriónico (CEA) a partir de tumores de colon humano; se obtuvieron antisueros al extracto perclórico de glicoproteínas de colon normal y de colon tumoral, y al CEA puro en conejos. Se comprobó por electroforesis en gel de poliacrilamida que, al inmunizar en forma prolongada con el extracto tumoral, hubo aumento de proteínas de movilidad alfa2. Los antisueros obtenidos rinden por imnunodifusión bajos títulos al enfrentarlos a los distintos antígenos examinados. En general se obtienen los mayores títulos con la fracción obtenida por focalización isoeléctrica del extracto perclórico de glico proteínas de colon tumoral, y este fenómeno se repite al titular los antisueros por radioinmunoensayo (RIE). Al efectuar el análisis estadístico de los resultados obtenidos al medir la concentración de CEA en muestras de sueros de pacientes, no se obtuvieron diferencias significativas al usar sueros provenientes de distintas sangrías. Se concluye que para cubrir un amplio rango de concentraciones en la medición de CEA por RIE es suficiente purificar al antígeno que se usará, como "standard" y trazador hasta la etapa de focalización, y utilizar de anti-sueros obtenidos de animales inyectados con extracto perclórico de glicoproteínas de colon tumoral con esquemas de inmunización largos o con CEA puro con un esquema corto
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Adulto , Coelhos , Animais , Humanos , Anticorpos Antineoplásicos/imunologia , Antígeno Carcinoembrionário/isolamento & purificação , Colo/imunologia , Neoplasias do Colo/imunologia , Extratos de Tecidos/imunologia , Soros Imunes/imunologia , Imunodifusão , Imunoeletroforese , RadioimunoensaioRESUMO
Se aisló y purificó antígeno carcinoembriónico (CEA) a partir de tumores de colon humano; se obtuvieron antisueros al extracto perclórico de glicoproteínas de colon normal y de colon tumoral, y al CEA puro en conejos. Se comprobó por electroforesis en gel de poliacrilamida que, al inmunizar en forma prolongada con el extracto tumoral, hubo aumento de proteínas de movilidad alfa2. Los antisueros obtenidos rinden por imnunodifusión bajos títulos al enfrentarlos a los distintos antígenos examinados. En general se obtienen los mayores títulos con la fracción obtenida por focalización isoeléctrica del extracto perclórico de glico proteínas de colon tumoral, y este fenómeno se repite al titular los antisueros por radioinmunoensayo (RIE). Al efectuar el análisis estadístico de los resultados obtenidos al medir la concentración de CEA en muestras de sueros de pacientes, no se obtuvieron diferencias significativas al usar sueros provenientes de distintas sangrías. Se concluye que para cubrir un amplio rango de concentraciones en la medición de CEA por RIE es suficiente purificar al antígeno que se usará, como "standard" y trazador hasta la etapa de focalización, y utilizar de anti-sueros obtenidos de animales inyectados con extracto perclórico de glicoproteínas de colon tumoral con esquemas de inmunización largos o con CEA puro con un esquema corto (AU)
Assuntos
Adulto , Coelhos , Animais , Humanos , Anticorpos Antineoplásicos/imunologia , Antígeno Carcinoembrionário/isolamento & purificação , Colo/imunologia , Extratos de Tecidos/imunologia , Neoplasias do Colo/imunologia , Imunoeletroforese , Radioimunoensaio , Soros Imunes/imunologia , ImunodifusãoRESUMO
Carcinoembryonic antigen (CEA) was purified after perchloric acid extraction of glycoprotein from human normal and tumoral colon. Antibodies against those extracts as well as purified CEA were raised in rabbits. Sera obtained from animals immunized with tumoral extract in protracted schemes showed disperse behavior on polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) for proteins in the area with gamma, mobility which were markedly increased. In addition, a large increase of proteins with a mobility comparable to alpha 2 proteins was observed. The latter increase was not present in sera of rabbits immunized with normal colon extracts. Low titer antisera were obtained after immunization with either antigen as revealed by immunodiffusion. The relatively highest titers were seen against the glycoprotein fraction of tumor extracts which had previously been enriched by isoelectric focusing. Immunoelectrophoresis of tumor extracts against homologous antisera revealed bands with beta mobility due to the presence of CEA antibodies only in the sera of animals injected with tumor extracts. Antibody titers assayed by radioimmunoassay (RIA) revealed that the highest titers were obtained from tumor glycoprotein extracts was used as an immunogen. Measurements of CEA concentrations in serum of patients with low and high levels of CEA showed non significant differences by statistical analysis, when antisera obtained from different bleedings of the same animals were used. It is concluded that in order to establish a CEA RIA for clinical purposes it is necessary to purify up to the isoelectric focusing step the material to be labelled as tracer or used as standard. Antibody reagent may be obtained by immunizing schemes or protracted schemes using crude perchloric acid extracts of colon tumor.