RESUMO

A fertilização envolve um processo complexo e requer muitos atributos espermáticos para seu sucesso.Há uma grande variação no sêmen de diferentes touros e partidas, o que causa uma oscilação no potencial defertilidade. A inseminação artificial em tempo fixo (IATF) utilizando partidas de sêmen com reduzido potencialde fertilidade causa um grande impacto na produtividade do rebanho. Partidas de sêmen que apresentamcaracterísticas de motilidade progressiva, vigor, defeitos morfológicos e concentração dentro das aceitáveis parao uso na IA podem mostrar deficiência no potencial de fertilidade, o que pode ser atribuído a alterações emestruturas ou funções espermáticas não contempladas nestas avaliações. Várias técnicas vêm sendodesenvolvidas buscando a identificação de alterações espermáticas que resultam em falha na fertilidade;revelando com mais precisão lesões nas células espermáticas após o processo de criopreservação. Este texto visaabordar, baseados principalmente em nossas experiências, as falhas de fertilidade inerentes ao sêmen e o quantoas técnicas laboratoriais podem predizer sobre o potencial de fertilidade de uma partida de sêmen antes do uso naIATF e seu impacto sobre a fertilidade do rebanho.(AU)

Fertilization involves a complex process and requires many sperm attributes for its success. There isgreat variation in the semen of different bulls and batch, which causes an oscillation in fertility potential. Theuse in TAI of semen batch with reduced fertility potential causes a great impact on the productivity of the herd.Semen batches that exhibit characteristics of progressive motility, vigor, morphological defects andconcentration within those acceptable for use in AI may show reduction in fertility potential, which may beattributed to changes in structures or sperm functions not contemplated in these evaluations. Several techniqueshave been developed to identify sperm alterations that result in failure of fertility; revealing more accuratelysperm cell lesions after the cryopreservation process. This paper aims to address, essentially based on ourexperiences, fertility failures inherent to semen and how laboratory techniques can predict the fertility potentialof a semen batch prior to use in TAI and its impact on herd fertility.(AU)

Assuntos

RESUMO

A utilização de técnicas avançadas para a analise de sêmen de cachaços apesar de ainda ser restrita adeterminados setores do sistema de produção de suínos, tem se tornado aplicável e de extrema importânciadentro, tanto de centrais comerciais de sêmen como nos centros de pesquisas ao redor do mundo. Dentre taistecnologias, pode-se citar as análises computadorizadas da motilidade associada a avaliação da morfometriaespermática, além das avaliações por sondas fluorescentes averiguando-se as integridades dos mais diferentescompartimentos celulares, podendo tais técnicas serem realizadas não apenas por microscopia deepifluorescência, mas também por citometria de fluxo. Entretanto, deve-se destacar a não individualização dastécnicas abordadas, devido a inter-relação das estruturas espermáticas perante o processo de fertilização. Assim,as diversas avaliações devem ocorrer simultaneamente, tendo em vista a necessidade da perfeita integridadedeste conjunto de estruturas para a perfeita fisiologia da célula espermática.(AU)

The use of advanced boar semen analysis although it is restricting to certain sectors of the swineproduction system, it is becoming relevant and extremely important in both commercial AI and research centersaround the world. Of all technologies available, one may mention the computerized motility analysis (CASA)combined with sperm morphology (ASMA), and the use of fluorescent probes to verify the integrity of thedifferent cellular compartments by means of epifluorescence microscopy or flow cytometry. However, it shouldbe emphasized the non-individualization of the techniques discussed, due to the necessity of the perfect integrityof this set of structures for the perfect sperm cell physiology.(AU)

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A fertilização envolve um processo complexo e requer muitos atributos espermáticos para seu sucesso.Há uma grande variação no sêmen de diferentes touros e partidas, o que causa uma oscilação no potencial defertilidade. A inseminação artificial em tempo fixo (IATF) utilizando partidas de sêmen com reduzido potencialde fertilidade causa um grande impacto na produtividade do rebanho. Partidas de sêmen que apresentamcaracterísticas de motilidade progressiva, vigor, defeitos morfológicos e concentração dentro das aceitáveis parao uso na IA podem mostrar deficiência no potencial de fertilidade, o que pode ser atribuído a alterações emestruturas ou funções espermáticas não contempladas nestas avaliações. Várias técnicas vêm sendodesenvolvidas buscando a identificação de alterações espermáticas que resultam em falha na fertilidade;revelando com mais precisão lesões nas células espermáticas após o processo de criopreservação. Este texto visaabordar, baseados principalmente em nossas experiências, as falhas de fertilidade inerentes ao sêmen e o quantoas técnicas laboratoriais podem predizer sobre o potencial de fertilidade de uma partida de sêmen antes do uso naIATF e seu impacto sobre a fertilidade do rebanho.

Fertilization involves a complex process and requires many sperm attributes for its success. There isgreat variation in the semen of different bulls and batch, which causes an oscillation in fertility potential. Theuse in TAI of semen batch with reduced fertility potential causes a great impact on the productivity of the herd.Semen batches that exhibit characteristics of progressive motility, vigor, morphological defects andconcentration within those acceptable for use in AI may show reduction in fertility potential, which may beattributed to changes in structures or sperm functions not contemplated in these evaluations. Several techniqueshave been developed to identify sperm alterations that result in failure of fertility; revealing more accuratelysperm cell lesions after the cryopreservation process. This paper aims to address, essentially based on ourexperiences, fertility failures inherent to semen and how laboratory techniques can predict the fertility potentialof a semen batch prior to use in TAI and its impact on herd fertility.

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RESUMO

A utilização de técnicas avançadas para a analise de sêmen de cachaços apesar de ainda ser restrita adeterminados setores do sistema de produção de suínos, tem se tornado aplicável e de extrema importânciadentro, tanto de centrais comerciais de sêmen como nos centros de pesquisas ao redor do mundo. Dentre taistecnologias, pode-se citar as análises computadorizadas da motilidade associada a avaliação da morfometriaespermática, além das avaliações por sondas fluorescentes averiguando-se as integridades dos mais diferentescompartimentos celulares, podendo tais técnicas serem realizadas não apenas por microscopia deepifluorescência, mas também por citometria de fluxo. Entretanto, deve-se destacar a não individualização dastécnicas abordadas, devido a inter-relação das estruturas espermáticas perante o processo de fertilização. Assim,as diversas avaliações devem ocorrer simultaneamente, tendo em vista a necessidade da perfeita integridadedeste conjunto de estruturas para a perfeita fisiologia da célula espermática.

The use of advanced boar semen analysis although it is restricting to certain sectors of the swineproduction system, it is becoming relevant and extremely important in both commercial AI and research centersaround the world. Of all technologies available, one may mention the computerized motility analysis (CASA)combined with sperm morphology (ASMA), and the use of fluorescent probes to verify the integrity of thedifferent cellular compartments by means of epifluorescence microscopy or flow cytometry. However, it shouldbe emphasized the non-individualization of the techniques discussed, due to the necessity of the perfect integrityof this set of structures for the perfect sperm cell physiology.

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This study aimed to evaluate physically and structurally ejaculates from locally adapted goats in therainy season. Semen pool formed by the four goats of each breed was evaluated for physical, diluted in Tris-eggyolk and frozen. After thawing, it was diluted in Tris and incubated with carboxyfluorescein diacetate andpropidium iodide, to evaluate the integrity of the plasma membrane and JC1 to assess mitochondrial activity.The percentage of cells with damaged membrane and mitochondrial activity in spermatozoa between breed werecompared, every hour for three hours. There was no significant difference (P > 0,05) in relation to thepercentage of cells with damaged plasma membrane, as well as between the incubation times. The Azul breedhad lower mitochondrial activity (P < 0,05). The evaluated semen of all breeds showed no significant damage tothe plasma membrane in the rainy season, but the Azul breed had lower mitochondrial activity in sperm cells.

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This study aimed to evaluate physically and structurally ejaculates from locally adapted goats in therainy season. Semen pool formed by the four goats of each breed was evaluated for physical, diluted in Tris-eggyolk and frozen. After thawing, it was diluted in Tris and incubated with carboxyfluorescein diacetate andpropidium iodide, to evaluate the integrity of the plasma membrane and JC1 to assess mitochondrial activity.The percentage of cells with damaged membrane and mitochondrial activity in spermatozoa between breed werecompared, every hour for three hours. There was no significant difference (P > 0,05) in relation to thepercentage of cells with damaged plasma membrane, as well as between the incubation times. The Azul breedhad lower mitochondrial activity (P < 0,05). The evaluated semen of all breeds showed no significant damage tothe plasma membrane in the rainy season, but the Azul breed had lower mitochondrial activity in sperm cells.(AU)

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A mitocôndria é a principal fonte de energia para a motilidade e a homeostase espermática. Durante afosforilação oxidativa são produzidos metabólitos, denominados espécies reativas de oxigênio (EROs), as quaisdesempenham papel fundamental nos processos fisiológicos. No entanto, disfunções mitocondriais podem causardesequilíbrio entre a produção de EROs e os mecanismos antioxidantes, provocando o estresse oxidativo, letalpara a célula espermática. Assim, como essa organela está envolvida tanto nos processos fisiológicos quanto nospatológicos dos espermatozoides, fica clara a importância de se avaliar sua funcionalidade. Portanto, o objetivodesta revisão é descrever as possíveis técnicas de avaliação da funcionalidade das mitocôndrias espermáticas pormeio da atividade e do potencial da membrana mitocondrial, da mensuração dos níveis de ATP e ADP e damensuração dos níveis de cálcio.(AU)

Mitochondria are the major source of energy for sperm motility and to the homeostasis. During theoxidative phosphorylation metabolites called Reactive Oxygen Species (ROS), are produced and play a key rolefor the physiological processes. However, mitochondrial dysfunctions can cause an imbalance between ROSproduction and antioxidant mechanisms cause oxidative stress, lethal for spermatozoa. Thus, as this organelle isinvolved both in physiological or pathological processes of sperm, it is clear the importance of evaluating itsfunctionality. Therefore, the aim of this review is to describe the possible techniques for assessing functionalityof sperm mitochondria and these assessments of activity and mitochondrial membrane potential, measuring thelevels of ATP and ADP and measurement the levels of calcium.(AU)

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A mitocôndria é a principal fonte de energia para a motilidade e a homeostase espermática. Durante afosforilação oxidativa são produzidos metabólitos, denominados espécies reativas de oxigênio (EROs), as quaisdesempenham papel fundamental nos processos fisiológicos. No entanto, disfunções mitocondriais podem causardesequilíbrio entre a produção de EROs e os mecanismos antioxidantes, provocando o estresse oxidativo, letalpara a célula espermática. Assim, como essa organela está envolvida tanto nos processos fisiológicos quanto nospatológicos dos espermatozoides, fica clara a importância de se avaliar sua funcionalidade. Portanto, o objetivodesta revisão é descrever as possíveis técnicas de avaliação da funcionalidade das mitocôndrias espermáticas pormeio da atividade e do potencial da membrana mitocondrial, da mensuração dos níveis de ATP e ADP e damensuração dos níveis de cálcio.

Mitochondria are the major source of energy for sperm motility and to the homeostasis. During theoxidative phosphorylation metabolites called Reactive Oxygen Species (ROS), are produced and play a key rolefor the physiological processes. However, mitochondrial dysfunctions can cause an imbalance between ROSproduction and antioxidant mechanisms cause oxidative stress, lethal for spermatozoa. Thus, as this organelle isinvolved both in physiological or pathological processes of sperm, it is clear the importance of evaluating itsfunctionality. Therefore, the aim of this review is to describe the possible techniques for assessing functionalityof sperm mitochondria and these assessments of activity and mitochondrial membrane potential, measuring thelevels of ATP and ADP and measurement the levels of calcium.

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A análise de sêmen in vitro é importante para evitar prejuízos em programas de inseminação artificial eauxiliar o técnico na escolha de reprodutores para estações de monta. Ainda que as técnicas mais avançadas deavaliação de sêmen ovino estejam restritas a centros de pesquisa, avanços nessa área aumentam a acurácia e arepetibilidade das análises. Foram desenvolvidas tecnologias objetivas de avaliação do sêmen que utilizamsistemas computadorizados e softwares específicos para examinar imagens dos espermatozoides. A análise demotilidade assistida por computador utiliza fotografias sequenciais em que é possível desenhar o trajeto dascélulas espermáticas.Essa tecnologia tem sido aplicada na pesquisa de novos diluidores e crioprotetoresseminais. A morfometria computadorizada diminui a subjetividade da tradicional análise de morfologiaespermática realizada manualmente. A aplicação de sondas fluorescentes com leitura em microscopia defluorescência ou citometria de fluxo permite a avaliação estrutural e funcional dos espermatozoides de formamais ampla, criteriosa e rápida. A pesquisa da capacidade de degradação das espécies reativas de oxigênioauxilia na preservação do sêmen tanto congelado quanto descongelado, e vem sendo utilizada na melhoria demeios para criopreservação. Os testes biológicos, ainda que onerosos na pesquisa em ovinos, geram informaçõesimportantes sobre a sobrevida dos espermatozoides no trato reprodutivo feminino e sua capacidade fecundante.

In vitro semen analysis is important to prevent errors in artificial insemination programs and assist thetechnician in choosing rams for breeding seasons. While the most advanced assessment techniques ram semenare restricted to research centers, advances in this area increase the accuracy and repeatability of analyzes.Objective semen evaluation technologies using specific computer systems and software to examine images ofsperm were developed. The analysis of computer-assisted motility uses sequential shots that can draw the path ofthe sperm cells, this technology has been applied in search of new extenders and seminal cryoprotectants. Thecomputerized morphometry reduces the subjectivity of traditional sperm morphology analysis performedmanually. The use of fluorescent probes reading fluorescence microscopy or flow cytometry allows structuraland functional assessment of sperm in a more extensive and faster analysis. The research capacity ofdegradation of reactive oxygen species assists in the preservation of frozen and thawed semen, and has beenused in improving the means for cryopreservation. The biological tests, albeit costly research in sheep generateimportant information on the survival of spermatozoa in the female reproductive tract and their fertilizingcapacity.

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A análise de sêmen in vitro é importante para evitar prejuízos em programas de inseminação artificial eauxiliar o técnico na escolha de reprodutores para estações de monta. Ainda que as técnicas mais avançadas deavaliação de sêmen ovino estejam restritas a centros de pesquisa, avanços nessa área aumentam a acurácia e arepetibilidade das análises. Foram desenvolvidas tecnologias objetivas de avaliação do sêmen que utilizamsistemas computadorizados e softwares específicos para examinar imagens dos espermatozoides. A análise demotilidade assistida por computador utiliza fotografias sequenciais em que é possível desenhar o trajeto dascélulas espermáticas.Essa tecnologia tem sido aplicada na pesquisa de novos diluidores e crioprotetoresseminais. A morfometria computadorizada diminui a subjetividade da tradicional análise de morfologiaespermática realizada manualmente. A aplicação de sondas fluorescentes com leitura em microscopia defluorescência ou citometria de fluxo permite a avaliação estrutural e funcional dos espermatozoides de formamais ampla, criteriosa e rápida. A pesquisa da capacidade de degradação das espécies reativas de oxigênioauxilia na preservação do sêmen tanto congelado quanto descongelado, e vem sendo utilizada na melhoria demeios para criopreservação. Os testes biológicos, ainda que onerosos na pesquisa em ovinos, geram informaçõesimportantes sobre a sobrevida dos espermatozoides no trato reprodutivo feminino e sua capacidade fecundante.(AU)

In vitro semen analysis is important to prevent errors in artificial insemination programs and assist thetechnician in choosing rams for breeding seasons. While the most advanced assessment techniques ram semenare restricted to research centers, advances in this area increase the accuracy and repeatability of analyzes.Objective semen evaluation technologies using specific computer systems and software to examine images ofsperm were developed. The analysis of computer-assisted motility uses sequential shots that can draw the path ofthe sperm cells, this technology has been applied in search of new extenders and seminal cryoprotectants. Thecomputerized morphometry reduces the subjectivity of traditional sperm morphology analysis performedmanually. The use of fluorescent probes reading fluorescence microscopy or flow cytometry allows structuraland functional assessment of sperm in a more extensive and faster analysis. The research capacity ofdegradation of reactive oxygen species assists in the preservation of frozen and thawed semen, and has beenused in improving the means for cryopreservation. The biological tests, albeit costly research in sheep generateimportant information on the survival of spermatozoa in the female reproductive tract and their fertilizingcapacity.(AU)

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O estresse oxidativo é prejudicial a diversas características espermáticas, como motilidade e integridade das membranas plasmática, acrossomal e mitocondrial, podendo levar a redução da fertilidade, inclusive no sêmen refrigerado. Poucos estudos foram realizados utilizando-se a melatonina com o intuito de melhorar as características espermáticas em equinos. O mioinositol e o ácido ferúlico, por sua vez, nunca foram utilizados nessa espécie. O presente trabalho teve como objetivo avaliar a influência desses compostos nas características do sêmen equino refrigerado. Para isso, foram utilizadas quatro ejaculados, de quatro animais conhecidamente férteis, com idade entre 4 e 8 anos. Após a coleta, o sêmen foi distribuído entre os quatro tratamentos, sendo eles, melatonina, ácido ferúlico, mioinositol e controle, utilizando-se diluidor á base de leite desnatado, na concentração de 25 milhões de espermatozoides por mL. As amostras foram refrigeradas à 5°C, sob uma curva de refrigeração de 0,09°C/min e avaliadas com 0, 4 e 8 horas de refrigeração, quanto às características de motilidade (CASA), integridade das membranas plasmática, acrossomal e o potencial de membrana mitocondrial (utilizando-se as sondas fluorescentes PI, H342, FITC-PSA e JC-1, por microscopia de epifluorescência), e quantificação da produção de espécies reativas de oxigênio (utilizando-se a sonda fluorescente DCFH-DA, por fluorímetria). Os dados obtidos foram analisados pelo programa SAS, versão 9.3 (SAS, 2011). [...] A fluorescência emitida, relativa à quantidade de espécies reativas de oxigênio presentes na amostra não foi alterada pelos tratamentos, em nenhum dos tempos. Com isso conclui-se que a adição de melatonina e ácido ferúlico aumenta a porcentagem de células com alto potencial de mitocôndria, sugerindo a adição desses compostos ao diluidor visando maior manutenção da viabilidade por até 8 horas de refrigeração.

Oxidative stress is detrimental to several sperm characteristics such as motility, plasma, acrosomal and mitochondrial membrane integrity, and can lead to reduced fertility, also in cooled semen. Few studies were performed using melatonin intending an improvement in equine sperm characteristics. Para isso, foram utilizadas quatro ejaculados, de quatro animais conhecidamente férteis, com idade entre 4 e 8 anos. Myoinositol and ferulic acid, in turn, were never used in this species. The objective of the present study was to evaluate the influence of these compounds in equine cooled semen characteristics. Four collections from four stallions of known fertility aged between 4 and 8 years old were used. After collection, semen was distributed in one of the four treatments, melatonin, ferulic acid, myoinositol and control. A skim milk based extender was used and semen was diluted to a final concentration of 25 million sperm per mL. Samples were cooled at 5°C, at a cooling rate of 0.09°C/min and evaluated at 0, 4 and 8 hoours of cooling. CHaracteristics anlyzed were motility (CASA), plasma and acrosomal membrane integrity mytochondrial membrane potential (using florescente probes PI, H342, FITC-PSA e JC-1, using epifluorescence microscopy), and reactive oxygen species production quantification (using DCFH-DA fluorescente probe, by fluorimetry. [...] Percentage of cells with intact acrosomal membrane (IAM) was higher in melatonin treated group (99.69± 0.07) than all the other groups (99.41 ± 0.09; 99.33 ± 0.09; 99.39 ± 0.09; myoinositol, ferulic acid and control, respectively). Concerning reactive oxygen species in the sample, emitted fluorescence was not altered by treatments at any moment evaluated. It can be concluded that the addition of melatonin and ferulic acid the percentage of high mitochondrial potential cells, suggesting a beneficial utilization of these coumpounds in the extender for a greater maintenance of viability up to 8 hours of cooling.

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Incrementar a eficiência do processo de refrigeração do sêmen é de grande interesse na reprodução da espécie equina, à medida que a população de equinos cresce, também aumenta a demanda para a comercialização e transporte de sêmen refrigerado. Esse trabalho foi realizado para verificar os efeitos de diferentes diluidores para refrigeração de sêmen equino a 5°C sobre a cinética, membranas, morfologia e cromatina espermáticas durante 12 horas de armazenagem. Foram utilizados quatro ejaculados de quatro garanhões de diferentes raças, colhidos em intervalos semanais. Imediatamente após a colheita, o sêmen in natura foi avaliado quanto ao movimento espermático utilizando-se o sistema computadorizado de análise espermática (CASA), integridade das membranas plasmática e acrossomal e o potencial de membrana mitocondrial, utilizando-se sondas fluorescentes (PI, H342, FITCPSA e JC-1, por microscopia de epifluorescência), morfologia espermática por microscopia de contraste de interferência diferencial (DIC) e desnaturação da cromatina pela coloração de Azul de Toluidina. Logo após as análises, o sêmen foi diluído usando-se três diluidores diferentes: SMT, à base de leite desnatado e meio de Tyrode (adaptado de: PADILLA; FOOTE, 1991), BSAG, diluidor contendo BSA (adaptado de: GIBB et al., 2011) e SMK, à base de leite desnatado (KENNEY et al., 1975; controle), em seguida foi envasado em bisnagas na concentração de 50 x 106 sptz/mL e refrigerado a 5°C em caixas BotuFLEX® (Botupharma, Botucatu-SP), durante um período de 12 horas. [...] Conclui-se que a refrigeração do sêmen equino a 5ºC altera a cinética espermática de forma oscilante entre os diluidores no decorrer do tempo até 12 horas. Os diluidores SMT e o SMK preservam melhor a cinética, integridade de membranas e morfologia espermática do que o diluidor BSAG.

To develop the efficiency of cooling semen is the great advantage in the equine reproduction, as according to the equine population to grow up, too increase the demand to market and transport of cooling semen. This experiment was performed to verify the effects of different extenders to equine cooling semen at 5°C on the sperm kinetic, membranes, morphology and chromatin during 12 hours of storage. Were utilized four ejaculates from four stallions of different breeds, collected a week. Immediately after the collection, the in natura semen was evaluated as the sperm movement using the Computer-Assisted Semen Analysis (CASA), integrity of plasma and acrossomal membranes and mitochondrial membrane potential, using the fluorescent probes (PI, H342, FITC-PSA and JC-1, by epifluorescência microscopy), sperm morphology by microscopy of differential interference contrast (DIC) and chromatin denaturation by Toluidine blue. As soon as finished the analyses, the semen was diluted using three different extenders: SMT, skim milk based and Tyrode medium (adapted from PADILLA; FOOTE, 1991), BSAG, extender containing BSA (adapted from GIBB et al., 2011) and SMK, skim milk based (KENNEY et al., 1975; control), following was packed in flasks at 50 x 106sperm/mL concentration and cooling at 5°C in BotuFLEX® (Botupharma, Botucatu-SP) box, during 12 hours. The semen was analyzed 5 minutes after dilution (T0), 4 (T4), 8 (T8) and 12 hours (T12) after cooling about sperm movement, plasma and acrossomal membranes integrity and mitochondrial membrane potential sperm morphology and chromatin denaturation. The statistical analysis was performed using Statistical Analysis System (SAS inst. Inc.) software. [...] It was concluded that the equine semen cooling at 5ºC change the sperm kinetic oscillating way among extenders during the time until 12 hours. The SMT and SMK extenders are better to preserve the sperm kinetic, membranes integrity and morphology than BSAG extender.

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O processo de criopreservação acarreta uma série de alterações resultando em uma marcante redução da fertilidade. Buscam-se novas formas de avaliação do movimento espermático, tais como a análise das sub-populações espermáticas pelo sistema CASA. Sondas fluorescentes vêm sendo estudadas para avaliação da integridade do espermatozóide, fornecendo informações adicionais sobre sua funcionalidade. Tem se como objetivo otimizar o emprego do sistema CASA em combinação de sondas fluorescentes como nova forma de avaliação dos parâmetros qualitativos do sêmen congelado de ovinos. Em vinte e seis partidas de sêmen congelado procederam-se as avaliações CASA e Teste MITO. Utilizou-se a análise fatorial com método de rotação VARIMAX e análise de agrupamentos com método de Ward. Para análise optou-se por considerar a cinética individual de cada espermatozóide, ampliando o universo amostral de 26 médias para 5834 espermatozóides. Quanto as sondas fluorescentes, teste MITO, houve a classificação das amostras em oito categorias. Com a técnica exploratória multivariada houve a redução da dimensionalidade obtendo-se três fatores: fator F1, interpretado com um fator relacionado à progressividade do movimento; fator F2, representa um fator de deslocamento espermático sem considerar a direção do movimento; fator F3, diz respeito à energia disponível/ disponibilizada para a movimentação espermática.

RESUMO

O processo de criopreservação acarreta uma série de alterações resultando em uma marcante redução da fertilidade. Buscam-se novas formas de avaliação do movimento espermático, tais como a análise das sub-populações espermáticas pelo sistema CASA. Sondas fluorescentes vêm sendo estudadas para avaliação da integridade do espermatozóide, fornecendo informações adicionais sobre sua funcionalidade. Tem se como objetivo otimizar o emprego do sistema CASA em combinação de sondas fluorescentes como nova forma de avaliação dos parâmetros qualitativos do sêmen congelado de ovinos. Em vinte e seis partidas de sêmen congelado procederam-se as avaliações CASA e Teste MITO. Utilizou-se a análise fatorial com método de rotação VARIMAX e análise de agrupamentos com método de Ward. Para análise optou-se por considerar a cinética individual de cada espermatozóide, ampliando o universo amostral de 26 médias para 5834 espermatozóides. Quanto as sondas fluorescentes, teste MITO, houve a classificação das amostras em oito categorias. Com a técnica exploratória multivariada houve a redução da dimensionalidade obtendo-se três fatores: fator F1, interpretado com um fator relacionado à progressividade do movimento; fator F2, representa um fator de deslocamento espermático sem considerar a direção do movimento; fator F3, diz respeito à energia disponível/ disponibilizada para a movimentação espermática.

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Após a inseminação artificial, as fêmeas apresentam reação inflamatória transitória e fisiológica, que pode resultar em alterações na vascularização uterina. A ultrassonografia Doppler colorido é uma técnica não invasiva, que vem sendo utilizada para estudar a hemodinâmica do trato reprodutivo de bovinos. Os objetivos deste trabalho foram verificar a resposta inflamatória uterina por ultrassonografia Doppler colorido e a taxa de fertilidade em bovinos após inseminação artificial (IA) com sêmen avaliado por sondas fluorescentes. Para isso foram delineados dois experimentos. O experimento 1 foi realizado para estudar a hemodinâmica uterina por ultrassonografia Doppler colorido em bovinos após a IA. Foram utilizadas 18 vacas da raça Nelore, submetidas a um protocolo para a inseminação artificial em tempo fixo (IATF) e divididas em dois grupos: Grupo não inseminado (controle, GC, n=9) e grupo submetido à inseminação artificial (GIA, n=9). Avaliações por ultrassonografia foram realizadas em cinco momentos em modo espectral (30 horas antes da IA, 4, 24, 48 e 168 horas após a IA) para avaliar o índice de resistência (RI) da artéria uterina e em quatro momentos em modo color Doppler (4, 24, 48 e 168 horas após a IA) para avaliar a vascularização dos cornos uterinos. O diagnóstico de gestação foi feito após 30 dias da IA. No experimento 2 objetivou-se verificar se o percentual de espermatozóides com integridade das membranas plasmática e acrossomal e função mitocondrial (PIAIC) avaliadas por sondas fluorescentes influencia a fertilidade e estudar a hemodinâmica uterina após a deposição do sêmen com diferentes percentuais de espermatozóides PIAIC. Foram utilizadas 182 vacas paridas da raça Nelore, submetidas a um protocolo para IATF e divididas em três grupos de acordo com a qualidade do sêmen: Bom (B) 44,5%, Médio (M) 23% e Regular (R) 8,5% de espermatozóides PIAIC/palheta. Uma amostra de 30% das fêmeas (54, sendo 18 de cada grupo) foram submetidas a avaliações com ultrassonografia Doppler colorido 30 horas antes da IA, 4 e 24 horas após a IA. Foram considerados os RI das artérias uterinas direita (AD) e esquerda (AE) e vascularização subjetiva dos cornos uterinos direito (CD) e esquerdo (CE). Posteriormente, foram separados levando em consideração o lado do ovário contendo o folículo dominante para comparar RI das artérias ipsi (AI) e contralateral (AC) e vascularização subjetiva dos cornos uterinos ipsi (CI) e contralateral (CC). O diagnóstico de gestação foi realizado 30 dias após a IA. Para a análise estatística foi utilizado o programa SAS versão 9.2 (SAS 2010). As variáveis foram analisadas pelo PROC MIXED, utilizando modelo linear misto para medidas repetidas no tempo. Foram considerados os efeitos fixos de grupo, tempo e interação grupo x tempo....

After insemination, females have physiological and transient inflammatory reaction, which can result in changes in the uterine vasculature. The color Doppler ultrasound is a noninvasive technique that has been used to study the hemodynamics of cattle reproductive tract.The purposes of this work were to verify uterine inflammatory response by color Doppler ultrasound and fertility rate in cattle after artificial insemination (IA) with semen evaluated by fluorescent probes. For this, two experiments were delineated. The first experiment was conducted to study the uterine hemodynamic by color Doppler ultrasound in cattle after AI. Were used 18 Nellore cows that were subjected to a protocol for fixed timed artificial insemination (IATF). The animals were divided in two groups: Not inseminated group (control, GC, n=9) and inseminated group (GIA, n=9). Ultrasonografic evaluation were done in five moments on spectral mode (30 hours before AI, 4, 24, 48 e 168 hours after IA) to evaluate the resistence index (RI) of uterine artery and in four moments in color Doppler mode to evaluate the uterine horns vascularization. The pregnancy diagnostic was done 30 days after IA. In the second experiment the objective was to evaluate whether the percentage of sperm with plasma membrane integrity and acrossomal and mitochondrial function (PIAIC) assessed by fluorescent probes influences fertility and study the uterine hemodynamic after the deposition of semen with different percentages of PIAIC sperm. Were used 182 caved Nellore cows submitted to a protocol for IATF and divided into three groups according to semen quality: Good (B) 44.5%, Medium (M) 23% and Regular (R) 8,5% of PIAIC sperm/blade. A sample of 30% of female (54, 18 in each group) were submitted to evaluation by color Doppler ultrasound 30 hours before IA, 4 and 24 hours after IA. Were considered RI of right (AD) and left (AE) uterine arteries and subjective vascularization of right (CD) and left (CE) uterine horns. Later, they were separated taking into account the side of the ovary containing the dominant follicle to compare RI of ipsi (AI) and contralateral (AC) arteries and subjective vascularization of ipsi (CI) and contralateral (CC) uterine horns. The pregnancy diagnostic was done 30 days after IA. Statistical analysis was performed using the program SAS version 9.2 (SAS 2010). The variables were analyzed by PROC MIXED, using mixed linear model for repeated measures in time. We considered effects of group, time and group x time interaction. The data obtained were submitted to ANOVA and Duncan test, using PROC GLM. The chi-square analysis was used to determine pregnancy rate, according to the quality of semen by PROC FREQ. the significance level was 5%. In experiment 1 there were no differences of the parameters evaluated by Doppler ultrasound between GIA and GC, but time effects were noted for RI, it was lower four hours after IA. Wh...

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Com o propósito de obter resultados que demonstrem maior repetibilidade na avaliação da morfologia tanto quanto na função espermática, diversas técnicas laboratoriais tem sido desenvolvidas. Surgiram sistemas que utilizam a análise computadorizada de imagens, métodos de “coloração” empregando corantes fluorescentes (sondas fluorescentes) em microscopia de epifluorescência ou citometria de fluxo, que aumentaram a possibilidade de uma análise mais criteriosa da integridade estrutural dos espermatozóides. Os autores descrevem experiências, por mais de uma década, com a utilização destas biotécnicas, fazendo uma análise crítica, bem como apontando os desafios futuros, inclusive na área de biologia molecular espermática.(AU)

In order to obtain results showing greater repeatability in morphology and sperm function assessment, several laboratorial techniques have been developed continuously. Systems that utilize computerized image analysis, staining methods using fluorescent dies (fluorescent probes) in epifluorescence microscopy or flow cytometry, that allowed a more judicious evaluation of sperm structure integrity arose. Authors describe experiences, over a decade, with the use of these biotechiques, critically analyzing and pointing out future challenges, including the field of sperm molecular biology.(AU)

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RESUMO

A eficiência reprodutiva obtida no rebanho é dependente da fertilidade de ambos os progenitores. Entretanto, tende-se a atribuir maior responsabilidade pelos baixos índices de fertilidade ao final da estação de monta à fêmea, negligenciando-se a avaliação do reprodutor frente a estes resultados. Contudo, deve-se conferir maior importância às variáveis relacionadas ao macho, as quais podem contribuir diretamente para a determinação de menores taxas de fertilidade. Dentre essas variáveis destaca-se a qualidade seminal, sendo primariamente avaliada pela motilidade e morfologia espermática. No entanto, atualmente empregam-se exa- mes mais minuciosos, como: identificação de fatores de crescimento no plasma seminal, razão colesterol/fosfolipídios na membrana espermática, integridade das membranas acrossomal, mitocondrial e espermática exigindo, desta maneira, um conhecimento mais abrangente, por parte do examinador, para que se possa ter um maior poder diagnóstico e preditivo da fertilidade do reprodutor a ser utilizado.(AU)

Reproductive efficiency in the herd depends on the fertility of both mates. However, we tend to blame low fertility at the end of the breeding season to the female, ne- glecting to assess the male facing these results. However, more emphasis should be given on variables related to the male which can contribute directly to the de- termination of lower fertility rate. Among these variables, sperm quality is pointed out, which is primarily evaluated by motility and morphology. However, nowadays more detailed examinations are employed, such as identification of growth factors in seminal plasma, cholesterol/phospholipids ratio in the sperm membrane, acroso- me, mitochondrial and sperm membrane integrity, requiring a more comprehensive knowledge on the part of the examiner, who may have a greater diagnostic and predictive power of the fertility of the breeder to be used.(AU)

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RESUMO

Reproductive efficiency in the herd depends on the fertility of both mates. However, we tend to blame low fertility at the end of the breeding season to the female, neglecting to assess the male facing these results. However, more emphasis should be  given on variables related to the male which can contribute directly to the determination of lower fertility rate. Among these variables, sperm quality is pointed out, which is primarily evaluated by motility and morphology. However, nowadays more detailed examinations are employed, such as identification of growth factors in seminal plasma, cholesterol/phospholipids ratio in the sperm membrane, acrosome, mitochondrial and sperm membrane integrity, requiring a more comprehensive knowledge on the part of the examiner, who may have a greater diagnostic and predictive power of the fertility of the breeder to be used.

A eficiência reprodutiva obtida no rebanho é dependente da fertilidade de ambos os progenitores. Entretanto, tende-se a atribuir maior responsabilidade pelos baixos índices de fertilidade ao final da estação de monta à fêmea, negligenciando-se a avaliação do reprodutor frente a estes resultados. Contudo, deve-se conferir maior importância às variáveis relacionadas ao macho, as quais podem contribuir diretamente para a determinação de menores taxas de fertilidade. Dentre essas variáveis destaca-se a qualidade seminal, sendo primariamente avaliada pela motilidade e morfologia espermática. No entanto, atualmente empregam-se exames mais minuciosos, como: identificação de fatores de crescimento no plasma seminal, razão colesterol/fosfolipídios na membrana espermática, integridade das membranas acrossomal, mitocondrial e espermática exigindo, desta maneira, um conhecimento mais abrangente, por parte do examinador, para que se possa ter um maior poder diagnóstico e preditivo da fertilidade do reprodutor a ser utilizado.

RESUMO

Com o propósito de obter resultados que demonstrem maior repetibilidade na avaliação da morfologia tanto quanto na função espermática, diversas técnicas laboratoriais tem sido desenvolvidas. Surgiram sistemas que utilizam a análise computadorizada de imagens, métodos de “coloração” empregando corantes fluorescentes (sondas fluorescentes) em microscopia de epifluorescência ou citometria de fluxo, que aumentaram a possibilidade de uma análise mais criteriosa da integridade estrutural dos espermatozóides. Os autores descrevem experiências, por mais de uma década, com a utilização destas biotécnicas, fazendo uma análise crítica, bem como apontando os desafios futuros, inclusive na área de biologia molecular espermática.

In order to obtain results showing greater repeatability in morphology and sperm function assessment, several laboratorial techniques have been developed continuously. Systems that utilize computerized image analysis, staining methods using fluorescent dies (fluorescent probes) in epifluorescence microscopy or flow cytometry, that allowed a more judicious evaluation of sperm structure integrity arose. Authors describe experiences, over a decade, with the use of these biotechiques, critically analyzing and pointing out future challenges, including the field of sperm molecular biology.

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