RESUMO
Os carrapatos, artrópodes hematófagos, são vetores de doenças tais como febre maculosa das Montanhas Rochosas ou do Mediterrâneo, doença de Lyme, encefalite transmitida por carrapatos, babesiose e etc. No entanto, os fluidos dos carrapatos (saliva e hemolinfa) são misturas ricas em moléculas que exercem interessantes atividades farmacológicas, por exemplo, anticoagulante, antitumoral, antimicrobiana, dentre outras. Assim, os fluidos dos carrapatos podem ser considerados como potenciais fontes para a descoberta de novos medicamentos. Os carrapatos moles, denominados Argasídeos, são ectoparasitas que possuem hábitos alimentares característicos, pois excretam o excesso de sangue ingerido através de suas glândulas coxais, produzindo assim um fluido conhecido como líquido coxal (LC), mistura que contém carboidratos, proteínas, lipídios e ácidos nucléicos. O Ornithodoros rostratus é um dos argasídeos encontrados na América do Sul, principalmente no Brasil, Argentina, Paraguai e Bolívia, entretanto, até o momento, o líquido coxal de O. rostratus ainda não foi bem caracterizado. Portanto, os objetivos deste trabalho foram realizar uma caracterização bioquímica e verificar a atividade antibacteriana do LC do carrapato O. rostratus fracionado através de um protocolo otimizado. Para isto, aproximadamente 3,5 mL de LC foi coletado, esterilizado (membrana de 0,22 μm), liofilizado e reconstituído e, posteriormente, fracionado de acordo com sua massa molecular através de uma membrana de corte de 10 kDa (Amicon). Este procedimento resultou nas frações de Líquido Coxal de Alta Massa Molecular (LCAM) e Líquido Coxal de Baixa Massa Molecular (LCBM), as quais tiveram suas concentrações proteicas determinadas por BCA e por absorbância (em 214; 260 e 280 nm); além disso essas amostras foram submetidas aos ensaios bioquímicos por SDS-PAGE, RP-HPLC, análise proteômica, determinação de massas moleculares por MALDI-TOF e análise de atividade antibacteriana (inibição de crescimento de Staphylococcus aureus e Escherichia coli). Posteriormente as amostras LCAM e LCBM foram fracionadas por troca iônica utilizando membrana SDB-XC e as amostras obtidas foram analisadas por MALDI-TOF. A análise SDS-9 PAGE mostrou que as amostras LC e LCAM possuem três bandas proteicas principais (aproximadamente 60; 25 e 15 kDa) e como esperado, a amostra LCBM não apresentou bandas proteicas. A análise das amostras LCB, LCAM e LCBM por RP- HPLC resultou respectivamente em 26; 20 e 31 picos majoritários. A amostra LCBM (concentração proteica de 0,1μg/μL e sem alteração de pH) inibiu o crescimento de S. aureus, no entanto, nenhuma das amostras ensaiadas inibiram o crescimento de E. coli. A análise proteômica do LC resultou em 164 proteínas de artrópodes e 31 proteínas antimicrobianas quando comparados com seus respectivos banco de dados. Por sua vez, a análise proteômica de LCAM concentrado resultou em 500 proteínas de artrópodes e 264 proteínas antimicrobianas. Tendo em vista o elevado número de proteínas encontradas no LC, existe uma grande possibilidade de alguns desses compostos inibirem o crescimento de S. aureus.
RESUMO
Ornithodoros brasiliensis (Aragão) é um carrapato argasídeo, ectoparasita hematófago encontrado no Brasil, com distribuição restrita ao RS. Uma das características dos argasídeos é sua rápida ingurgitação, o que levou ao desenvolvimento de estratégias para manter a osmorregulação e o equilíbrio hidrostático, através da secreção do líquido coxal. O líquido coxal (LC) é o excesso de fluido corpóreo filtrado e secretado pelas glândulas coxais durante e após a alimentação. São eliminados compostos orgânicos, sais e água. O intuito deste estudo foi verificar a capacidade moduladora do LC do O. brasiliensis sobre o crescimento microbiano. Sabe-se que os carrapatos são excelentes vetores de microrganismos patogênicos ou não, e essa ação pode estar envolvida diretamente com determinadas moléculas presentes no LC. Neste contexto, testamos duas bactérias Gram (+) a Staphylococcus aureus e Micrococcus luteus e três Gram (-) Escherichia coli, Salmonella Typhimurium, Pseudomonas aeruginosa e a levedura Candida albicans. O LC foi coletado durante e após a alimentação dos carrapatos em coelhos (Oryctolagus cuniculus). Obteve-se um pool do LC de fêmeas e ninfas N4 alimentadas totalmente, que foi esterilizado em fluxo laminar com filtros de 0,22 μm (MilliPore), aliquotado e a dosagem protéica realizada em espectrofotômetro NanoDrop 2000 (Thermo) em A 280 nm. Para o fracionamento do LC utilizou-se filtros Vivaspin 6 (GE) com diferentes cortes 10, 30 e 50 kDa, e também Centrifugal Filter Units (Milli Pore), ambos centrifugados a 3.000 rpm, por até 15 min, a 4 oC. O ensaio de atividade antimicrobiana foi realizado através de diluição em caldo Mueller-Hinton (bactérias) ou caldo Sabouraud Dextrose (C. albicans), sendo realizada a leitura a 595 nm em Espectrofotômetro Multiskan EX (Thermo Fisher) após 20 horas de incubação a 37 °C. Os resultados demonstraram a capacidade do LC (0,14 μg/poço) modular o crescimento celular, sendo observada a variação da proliferação em todos os microrganismos. A maior proliferação foi apresentada pela bactéria M. luteus com 35,25 % e a menor atividade proliferativa foi para a levedura C. albicans com 2,57 %. A partir dos testes com as frações do líquido coxal observou-se que a C. albicans repetiu o padrão de inibição do crescimento celular e que provavelmente a principal atividade esteja na fração entre 10 e 30 kDa com 77 % de inibição. Já as bactérias apresentaram menor porcentagem de inibição, entretanto é possível observar uma variação de atividade relacionada às massas moleculares das amostras. Esses resultados sugerem que a E. coli talvez não seja patogênica ao carrapato, entretanto, já foi observado que os fungos podem ser usados no controle ambiental de carrapatos, isso explicaria a inibição da C. albicans, como uma defesa do carrapato. É necessário obter mais conhecimento sobre as moléculas que possam ser facilitadoras ou não para esses microrganismos, conhecer suas características e se são as mesmas que permitem que patógenos fiquem latentes dentro dos carrapatos.