RESUMO

The zinc-dependent metalloproteinases include families of proteins with essential function for homeostasis such as MMPs and ADAMs. These enzymes are involved in a wide variety of biological processes ranging from physiological cell proliferation and differentiation to pathological states associated with tumor metastasis, inflammation, tissue degeneration, and cell death. Snake Venom Metalloproteinases (SVMPs) are also zinc-dependent enzymes abundant in venoms of viper snakes. SVMPs are responsible for most local and systemic symptoms of human envenomings. As MMPs and ADAMs, SVMPs are synthesized as zymogens and the enzyme activation is regulated by hydrolysis of its pro-domain. However, very little is known about activation of SVMPs and where the hydrolysis of the pro-domain occurs. In this study, we attempted to identify and quantify the presence of pro-domains in different compartments of snake venom glands as zymogens or at free form, in order to enlighten some mechanism involved in SVMP activation. For this purpose, the prodomain of jararhagin (PD-Jar), a SVMP prevailing in the venom of Bothrops jararaca, was obtained in its recombinant form and used to immunize mice and rabbits to obtain antibodies specific to SVMP pro-domains, which were tested with samples of venom or glands tissues collected in different periods of the venom production cycle. By Western blotting, bands of 22 and 45 kDa, that correspond respectively to free pro-domains or zymogen of P-I SVMPs expected mobilities, were revealed in venom samples collected 4, 7 and 10 days after stimulus of venom production cycle. In venom glands, bands of zymogen molecular masses were detected in tissue extracts all along the cycle, but on the venom collected from the lumen these high molecularmass bands were detected only at the peak of venom production and not at the quiescent state. The antigens recognized by Western blots were immunoprecipitated with anti-PD-Jar and subjected to MS/MS. Pro-domain peptides were identified in all samples together with a few venom proteins that co-precipitated with SVMPs and the Glutamyl Peptide Cyclotransferase, involved in SVMP post-translational processing. In order to identify the location of these molecules within the venom secretory apparatus, gland tissues were submitted to immunofluorescence andimmunoelectronmicroscopy analysis. The results show positive staining of prodomain in secretory cells majorly at the secretory vesicles near the Golgi in the active glands. Taken together, our data shows that processing of SVMPs starts within secretory vesicles of venom gland secretory cells and occurs predominantly at the lumen of the venom gland just after the enzyme secretion. As such, SVMPactivation differs from ADAMs and MMPs, but can be used as a model for studying the relevance of peptides resulting from pro-domain processing and degradation for the control of metalloproteinases activity.

Metaloproteinases incluem famílias de proteínas com funções essenciais para a homeostase em diferentes seres vivos, tais como as MMPs e ADAMs. Estas enzimas estão envolvidas em uma grande variedade de processos biológicos tanto fisiológicos, como proliferação e diferenciação celular, quanto estados patológicos associados com a metástase de tumores, inflamação, degeneração de tecidos e morte celular. Metaloproteinases do veneno de serpentes (SVMPs) também são enzimas dependentes de zinco abundantes em venenos de serpentes. SVMPs são responsáveis pela maioria dos sintomas locais e sistêmicos do envenenamento humano. Tal como as MMPs e ADAMs, as SVMPs são sintetizadas como zimogênios e a ativação da enzima é regulada por meio de hidrólise do seu pródomínio. No entanto, muito pouco se sabe sobre a ativação de SVMPs e onde a hidrólise do pró-domínio ocorre. Neste estudo, buscou-se identificar e quantificar a presença de pró-domínios como zimogênios ou de forma livre em diferentes compartimentos da glândula de veneno, a fim de esclarecer alguns mecanismos envolvidos na ativação da SMVP. Para esta finalidade, o pró-domínio da jararagina (PD-Jar), uma SVMP prevalente no veneno de Bothrops jararaca, foi obtido na sua forma recombinante e usado para imunizar camundongos e coelhos para a obtenção de anticorpos anti-pró- omínio que foram testados com amostras de veneno ou glândulas coletadas em diferentes períodos do ciclo de produção de veneno. Por western blotting, as bandas de 22 e 45 kDa, que correspondem, respectivamente, ao pró-domínio livre e ao zimogênio de SVMP de classe P-I, foram revelados em amostras de veneno coletadas 4, 7 e 10 dias após o estímulo do ciclo de produção de veneno. No veneno coletado a partir do lúmen, bandas de alta massa molecular foram detectadas apenas no pico da produção de veneno e não no estado quiescente. Em glândulas de veneno, foram detectadas predominantemente as bandas de massas moleculares de zimogênios, em tecidos extraídos ao longo do ciclo. Os antígenos reconhecidos por Western blotting foram imunoprecipitados com anticorpo anti-PD-Jar e submetidos a MS/MS. Peptídeos de pró-domínio foram identificados em todas as amostras, juntamente com algumas proteínas do veneno que foram co-precipitadas e também o GPC (glutamyl peptide cyclotransferase), que está envolvido em processamentos pós-traducionais das SMVPs. A fim de identificar a localização destas moléculas no interior da glândula de veneno, os tecidos das glândulas foram submetidos à análise por imunofluorescência e imunoeletromicroscopia. Os resultados mostram a coloração positiva de pró-domínio em células secretoras majoritariamente nas vesículas secretoras perto do Golgi. Tomados em conjunto, os nossos dados mostram que o processamento das SVMPs começa dentro de vesículas secretoras de veneno das células secretoras e ocorre predominantemente no lúmen da glândula de veneno após a secreção das enzimas. Como tal, a ativação das SMVPs difere de ADAMs e MMPs, mas pode ser utilizado como um modelo para o estudo da relevância dos peptídeos resultantes do processamento e degradação do pró-domínio para o controle da atividade de metaloproteinases.