RESUMO
Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) causes hemorrhagic colitis and hemolytic uremic syndrome by producing Shiga toxin (Stx), a AB5 type toxin. The B subunit binds to ganglioside receptors, and the active A subunit is translocated into the cell, where it inhibits protein synthesis by acting on rRNA, leading to cell death. Diagnosis of these strains is not commonly done in the routine laboratory of low-income countries. Besides, therapy for intoxication is based on minimizing the symptoms, since no toxin antidote is available. Thus, the development of effective tools for toxin detection and therapy is highly relevant. Antibodies exhibit excellent high affinity for their specific antigens. To maintain the homogeneity and specificity of monoclonal antibodies, together with largescale production and low cost, genetic engineering has been used to develop recombinant antibodies. These include single chain variable fragments and antigenbinding fragments, which consist of antibody fragments that have antigen recognition regions. In the present study we obtained and characterized two different recombinant antibody fragments (Fab and scFv), produced in bacteria, against Stx toxins from STEC isolates. Furthermore, for the first time a human monovalent fragment was constructed (Fab), which was able to recognize and neutralize Stx toxins. These fragments obtained are promising tools for its use in the diagnosis and therapy of intoxication by STEC.
Linhagens de Escherichia coli produtoras da toxina de Shiga (STEC) causam colite hemorrágica e síndrome hemolítica urêmica pela produção da citotoxina de Shiga (Stx), uma toxina do tipo AB5, a subunidade B se liga ao receptor, e transloca a subunidade A ativa que inibe a síntese proteica por agir no rRNA levando à morte celular. O diagnóstico dessas linhagens não é realizado na rotina laboratorial de países em desenvolvimento e a terapia da intoxicação se baseia em tratar os sintomas, pois não há antídoto para a toxina. A obtenção de ferramentas para a detecção e terapia destas toxinas são de grande importância. Os anticorpos tem se mostrado moléculas excelentes como reagentes ligantes de alta afinidade à proteínas. Com o intuito de manter a homogeneidade e a especificidade dos anticorpos monoclonais, aliados ainda à produção em larga escala com baixo custo, a engenharia genética tem sido utilizada para obtenção de anticorpos recombinantes como os fragmentos variáveis de cadeia única e os fragmentos de ligação ao antígeno, que são fragmentos de anticorpos que possuem as regiões de reconhecimento ao antígeno. No presente trabalho foram obtidos e caracterizados dois tipos diferentes de fragmentos de anticorpos recombinantes (scFv e Fab), produzidos em bactérias, contra as toxinas Stx produzidas por isolados de STEC. Além disso, pela primeira vez, foi construído um fragmento monovalente humano (Fab), capaz de reconhecer e neutralizar as toxinas Stx. Estes fragmentos obtidos são promissores para seu uso como ferramentas tanto no diagnóstico como na terapia das intoxicações por STEC.
RESUMO
Accidents with snakes are a problem of public health. It is estimated that about 1.8 million poisonings by snakes occur every year worldwide, resulting in at least 94,000 deaths. This issue has been included in the list of neglected tropical diseases by the World Health Organization. Among the causative genera of snakebites in Brazil, the genus Crotalus has the highest coefficient of lethality. The venom of the rattlesnake Crotalus durissus terrificus (Cdt) is composed of a mixture of substances including toxins. The majority toxin and main toxic component of the venom is called crotoxin. It is highly toxic and is formed by subunits CA and CB. The administration of heterologous antibodies has been the treatment of choice for snake bite accidents. But its administration may cause hypersensitivity reactions. Furthermore, Crotalic antivenom production by horses is slow and hampered by the action of immunosuppressive components present in the venom of Cdt. Currently, recombinant antibody fragments are becoming popular alternative therapies for whole antibodies. Single chain fragment variable (scFv) comprise the VH and VL domains connected by a short linker flexible and may be useful as treatment for poisoning by snakes. Recombinant human antibodies anti-crotoxin have been previously isolated from a naive library of over 1010scFv by phage display technology. The aim of this study was the expression of original scFvs anti-crotoxin and mutants suggested by modeling molecular. ScFv6 3D model was constructed in silico. Docking and energy minimization calculations of CTX-antibody complex were also performed. From these simulations, three mutations were chosen. The S30A and Y31F mutants have mutation in CDR H2 and CDR H3 in the mutant R103H. The first mutant (S30A) was obtained by site-directed mutagenesis, while the other two (Y31F and R103H) were obtained from synthetic genes. ScFv original and mutants were cloned in pET20b + vector and expressed in E. coli C43 (DE3), resulting in soluble protein of approximately 30 kDa. Expression was induced with IPTG. After lysis, the bacterial content was purified by IMAC. The presence of the desired mutations was confirmed by sequencing. The secondary structure of scFvs was evaluated by circular dichroism and showed to be preserved. We conclude that original scFv and its mutants were clone and expressed successfully in soluble form. All scFv presented similar yield after purification. Moreover, they presented preserved secondary structure, as evaluated by circular dichroism.
Acidentes com serpentes são um problema de saúde pública. Estima-se que ocorram cerca de 1,8 milhões de envenenamentos por serpentes a cada ano no mundo, resultando em pelo menos 94 mil mortes. Tal problema foi incluído na lista de doenças tropicais negligenciadas da Organização Mundial da Saúde. Dentre o gêneros causadores de acidentes ofídicos no Brasil, o gênero Crotalus apresenta o maior coeficiente de letalidade. O veneno da cascavel Crotalus durissus terrificus (Cdt) é composto por uma mistura de substâncias, dentre elas as toxinas. A toxina majoritária e principal componente tóxico do veneno é denominada crotoxina. É altamente tóxica e é formada por duas subunidades CA e CB. A administração de anticorpos heterólogos tem sido o tratamento de escolha para indivíduos que sofreram acidentes ofídicos. Porém, sua administração pode causar reações de hipersensibilidade, além da sua produção ser lenta e dificultada pela ação de componentes imunossupressores presentes no veneno de Cdt. Atualmente, fragmentos de anticorpos recombinantes estão se tornando alternativas terapêuticas populares para substituição de anticorpos íntegros. Fragmentos variáveis de cadeia única (scFv, do inglês, single chain fragmente variable) são compostos dos domínios VH e VL unidos por um pequeno linker flexível e podem ser úteis como terapia para o envenenamento por serpentes. Anticorpos recombinantes humanos anti-crotoxina foram isolados previamente de uma biblioteca naive de mais 1010scFvs pela tecnologia de phage display. O objetivo desse estudo foi a expressão de scFvs anticrotoxina original e mutantes sugeridos por modelagem molecular. Um modelo 3D do scFv6 foi construído por modelagem in silico. Docking e cálculos de minimização de energia do complexo anticorpo-CTX também foram realizados. A partir dessas simulações, três mutações foram escolhidas. Os mutantes S30A e Y31F apresentam mutação no CDR H2 e o mutante R103H no CDR H3. O primeiro mutante (S30A) foi obtido por mutagênese sitio dirigida, enquanto os outros dois (Y31Fe R103H) foram obtidos através de genes sintéticos. O scFv original e os mutantes foram clonados em vetor pET20b+ e expressos em E.coli C43(DE3), resultando em proteínas solúveis de aproximadamente 30 kDa. A indução foi feita com IPTG. Após a lise bacteriana, o conteúdo foi purificado por IMAC. A presença das mutações desejadas foi confirmada por sequenciamento. A estrutura secundária dos scFvs foi avaliada por dicroísmo circular e se mostrou preservada. Concluímos que tanto o scFv original como os mutantes foram clonados e expressos com sucesso na forma solúvel. Todos os scFvs apresentaram rendimentos similares após a etapa de purificação. Além disto, os scFvs apresentaram estrutura secundária preservada, conforme avaliado por dicroísmo circular.
RESUMO
Monoclonal antibodies represent the fastest growing class of biopharmaceutical products and have a host of applications in medical research, diagnosis, therapy, and basic science. The production of recombinant monoclonal antibodies has revolutionized the generation of immunoglobulins, and their use represents a strategic breakthrough, affecting the global pharmaceutical market for therapeutic proteins. In the present work, a review of scFv, and the number of related patents, has been carried out. The results show that several countries have scFv patents, most notably the United States, China and United Kingdom. The target of these scFv antibodies was also assessed and the results demonstrate that most are directed toward cancer therapy.
Anticorpos monoclonais representam a classe de maior crescimento em produtos de biofármacos e possuem várias aplicações em pesquisa médica, diagnóstico, terapias e ciência básica. A produção de anticorpos monoclonais recombinantes revolucionou a geração de imunoglobulinas e sua utilização implica em avanço estratégico, afetando o mercado farmacêutico global de proteínas terapêuticas. No presente trabalho, uma revisão sobre scFv e a relação do seu número de patentes foi analisada. Os resultados mostram que vários países apresentam patentes de scFv com destaque para os Estados Unidos, China e Reino Unido. Os alvos desses anticorpos também foram avaliados e as análises revelaram que a maioria é destinado a terapias contra o câncer.