RESUMO

Resumen Objetivos: Establecer e implementar un protocolo simplificado de extracción, aislamiento primario y cultivo de células madre derivadas de la pulpa dental humana (DPSCh). Analizar cuantitativamente y cualitativamente las células aisladas. Metodología: 10 terceros molares sanos donados por pacientes que concurrieron a la Facultad de Odontología, UdelaR y otorgaron su consentimiento escrito fueron procesados antes de las 48 hs. Se realizó la fractura de la pieza para la obtención del tejido pulpar y se procesó por el método explante. Se analizó viabilidad celular y expresión de marcadores por citometría de flujo en pasajes 4 y 12 y se corroboró mediante inmunocitoquímica. Resultados: Las células obtenidas presentaron una vitalidad mayor al 90% en todos los pasajes, observándose una morfología característica y expresión de marcadores de células madre mesenquimales CD90, C105, CD73, CD29 y 166 mediante citometría de flujo en ambos pasajes. Conclusiones: Se logró establecer un protocolo de aislamiento y expansión celular, con alta tasa de éxito de una población de DPSCh.

Resumo Objetivos: Estabelecer e implementar um protocolo simplificado para a extração, isolamento primário e cultura de células-tronco da polpa dentária humana (DPSCh). Analise as células isoladas quantitativa e qualitativamente. Metodologia: 10 terceiros molares saudáveis ​​doados por pacientes que frequentaram a Faculdade de Odontologia UdelaR e deram consentimento por escrito foram processados ​​antes de 48 horas. A fratura da peça foi realizada para obtenção do tecido pulpar e processada pelo método do explante. A viabilidade celular e a expressão do marcador foram analisadas por citometría de fluxo nas passagens 4 e 12 e confirmadas por inmunocitoquímica. Resultados: As células obtidas apresentaram viabilidade superior a 90% em todas as passagens, observando uma morfologia característica e expressão dos marcadores de células-tronco mesenquimais CD90, C105, CD73, CD29 e 166 por citometría de fluxo em ambas as passagens. Conclusões: Foi possível estabelecer um protocolo de isolamento celular, com alta taxa de sucesso e segurança para isolar o DPSCh.

Abstract Objectives: To establish and implement a simplified protocol for the extraction, primary isolation, and culture of human dental pulp stem cells (hDPSCs). To analyze the isolated cells quantitatively and qualitatively. Methodology: Ten healthy third molars were donated by patients who attended the School of Dentistry, UdelaR, and gave their written consent. The teeth were processed within 48 hours. The teeth were sectioned to obtain the pulp tissue and processed with the explant method. Cell viability and marker expression were analyzed by flow cytometry at passages 4 and 12 and verified by immunocytochemistry. Results: The cells obtained had a vitality greater than 90% in all passages. We found the characteristic morphology and the expression of CD90, C105, CD73, CD29 and 166 mesenchymal stem cell markers by flow cytometry in both passages. Conclusion: It was possible to establish a cell isolation protocol that is highly successful and safe to isolate hDPSC.

Assuntos

RESUMO

Abstract Background: Pericardium tissue allograft can be used for surgical repair in several procedures. One of the tissue engineering strategies is the process of decellularization. This process decreases immunogenic response, but it may modify the natural extracellular matrix composition and behavior. Objective: The aim of this study was to evaluate the effectiveness of cell removal, maintenance of extracellular matrix properties and mechanical integrity of decellularized human pericardium using a low concentration solution of sodium dodecyl sulfate. Methods: Decellularization was performed with sodium dodecyl sulfate and ethylenediaminetetraacetic acid. Histological analysis, DNA quantification, evaluation of glycosaminoglycans and collagen were performed. Biomechanical assay was performed using tensile test to compare the decellularization effects on tissue properties of tensile strength, elongation and elastic modulus. P < 0.05 was considered significant. Results: There was reduction in visible nuclei present in pericardium tissue after decellularization, but it retained collagen and elastin bundles similar to fresh pericardium. The DNA contents of the decellularized pericardium were significantly reduced to less than 511.23 ± 120.4 ng per mg of dry weight (p < 0.001). The biomechanical assay showed no significant difference for fresh or decellularized tissue. Conclusion: The decellularization process reduces cell content as well as extracellular matrix components without changing its biomechanical properties.

Resumo Fundameto: O enxerto de pericárdio pode ser usado em muitos procedimentos de correção cirúrgica. Uma das estratégias da engenharia tecidual é o processo de descelularização. No entanto, embora esse processo diminua a resposta imunogênica, a descelularização pode modificar tanto o comportamento como a composição da matriz extracelular natural. Objetivos: Avaliar a eficácia da descelularização usando baixa concentração de dodecil sulfato de sódio na remoção celular, na manutenção das propriedades da matriz extracelular e na integridade mecânica do pericárdio humano descelularizado. Métodos: A descelularização foi realizada com dodecil sulfato de sódio e ácido etilenodiamino tetra-acético. Foi realizada análise histológica, quantificação de DNA, e avaliação de glicosaminoglicanos e colágeno. O estudo biomecânico foi conduzido pelo teste de tração para comparar os efeitos da descelularização sobre as propriedades teciduais de resistência à tração, alongamento e módulo de elasticidade. Foi considerado um valor de p < 0,05 como estatisticamente significativo. Resultados: Observou-se uma redução na quantidade de núcleos presentes no pericárdio após a descelularização, apesar de manter quantidades similares de feixes de elastina e de colágeno. As concentrações de DNA do pericárdio descelularizado foram significativamente reduzidas para menos que 511,23 ± 120,4 ng por mg de peso seco (p < 0,001). O teste biomecânico não apontou diferenças entre os tecidos fresco e descelularizado. Conclusão: A descelularização reduziu a concentração de células bem como os componentes da matriz extracelular sem afetar suas propriedades biomecânicas.

Assuntos

RESUMO

Haemophilus influenzae type b (Hib) is a Gram-negative bacterium, responsible for serious infections, such as pneumonia, sepsis and meningitis, especially in children younger than 5 years old and immunocompromised individuals. The main virulence factor of Hib is its polyribosyl-ribitol-phosphate capsular exopolysaccharide (PRP), which is used in the formulation of Hib vaccines, conjugated to a carrier protein. The production of the conjugated vaccine is complex and costly, particularly the PRP purification process, that comprises several steps of ethanol precipitation and centrifugation, and uses organic solvents and detergents. Targeting a more affordable vaccine that meets the public health systems demands, the Process Development Laboratory of Butantan Institute has been developing a simpler, economical and easily scalable purification process based on tangential flow filtration. In this process, one major bottleneck is the broth clarification step by microfiltration, which results in low PRP recovery and high variability, probably due to membrane fouling. Regarding this matter, a small scale study was previously performed, in order to identify the best operational conditions of relevant process variables, namely transmembrane pressure (TMP), feed flow, and permeate flow. The aim of this work was to scale up the broth clarification step using the defined conditions for these parameters and to perform a critical flux analysis, which is a very useful tool in tangential flow filtration optimization. Although PRP recovery was relatively smaller in the higher scale (68.5% against 97.5%), the permeate flow and TMP profiles were very similar. Analysis of PRP recovery profile indicated that extending dialysis might improve PRP yield. Critical flux of around 35 L.h-1 .m-2 was determined experimentally, which explains the high PRP recovery when a limit permeate flux of 25 L.h-1 .m-2 was employed in the cell clarification step. In conclusion, the process designed for broth clarification is quite promising in terms of product yield and scalability.

Haemophilus influenzae do tipo b (Hib) é uma bactéria Gram-negativa, responsável por infecções graves, como pneumonia, sepse e meningite, especialmente em crianças menores de 5 anos de idade e indivíduos imunocomprometidos. Seu principal fator de virulência é o exopolissacarídeo capsular de poliribosil-ribitol- fosfato (PRP), que é utilizado na formulação de vacinas contra Hib, conjugado a uma proteína carreadora. A produção da vacina conjugada é complexa e onerosa, principalmente o processo de purificação do PRP, caracterizado por várias etapas de precipitação com etanol, centrifugação e uso de solventes orgânicos e detergentes. Buscando uma vacina mais acessível, que possa atender à demanda de sistemas públicos de saúde, o Laboratório de Desenvolvimento de Processos vem desenvolvendo nos últimos anos um método de purificação mais simples, econômico e facilmente escalonável, baseado em filtração tangencial. Nesse processo, um dos gargalos identificados é a etapa de separação celular por microfiltração, que apresentava baixa recuperação de PRP e alta variabilidade dos resultados, provavelmente relacionados ao fenômeno de fouling. Um estudo em pequena escala foi realizado previamente para identificar as melhores condições de variáveis operacionais relevantes - pressão transmembrana (TMP), fluxo de entrada e fluxo do filtrado. O presente trabalho teve como objetivos escalonar o processo, mantendo essas condições, e realizar uma análise do fluxo crítico do filtrado, ferramenta bastante útil para a otimização da filtração tangencial. Embora a recuperação de PRP tenha sido relativamente menor no processo escalonado (68,5% contra 97,5%), os perfis de fluxo do filtrado e de TMP se mostraram muito semelhantes, e as análises da tendência de recuperação mostram que um aumento no número de diavolumes utilizado pode contornar essa questão. O valor de fluxo crítico determinado experimentalmente foi próximo de 35 L.h-1 .m-2 , o que corrobora os bons resultados obtidos com o uso de fluxo limite de 25 L.h-1 .m-2 para o filtrado no processo de separação celular. Os resultados obtidos mostram que o desenho de processo estabelecido para a clarificação de PRP é bastante promissor em termos de rendimento de PRP e escalabilidade do processo.

RESUMO

INTRODUÇÃO: O uso de recuperador de sangue (RS) em cirurgia cardíaca é proposto para diminuir o uso de unidades de concentrado de hemácias estocadas (UCH), que aumenta morbidade, mortalidade e reações inflamatórias. OBJETIVO: O objetivo deste estudo é avaliar se o uso do RS diminui o emprego de UCH, é custo/efetivo e traz benefícios ao paciente. MÉTODOS: Estudo prospectivo realizado entre novembro de 2009 e outubro de 2011, em 100 pacientes consecutivos, submetidos à cirurgia cardiovascular com circulação extracorpórea (CEC), hemodiluição mínima e hemofiltração. Os pacientes foram divididos em grupo 1 (sem RS) e 2 (com RS). Os critérios para a reposição de UCH foram instabilidade hemodinâmica e hemoglobina (Hb) <7-8g/dl. Foram analisados dados demográficos, Hb, hematócrito (Ht), drenagem mediastinal e reposição de UCH, em diversos intervalos, e tempos de CEC, UTI e hospital. RESULTADOS: Nos grupos 1 e 2, a idade média foi de 64,2 e 60,6 anos, com predominância do sexo masculino, o EuroSCORE logístico de 10,3 e 9,6 e a mortalidade de 2% e 4%, não relacionada ao estudo. O grupo 2 apresentou incidência de reoperações superior (12 x 6%), mas o número de UCH usado (4,31x1,25) e o tempo de internamento hospitalar (10,8x7,4) foram menores. Realizada análise uni e multivariada, que não demonstrou valores estatisticamente significativos, exceto no uso de UCH. A relação entre o custo do RS e das UCH foi custo/efetiva e o tempo de internamento, menor. CONCLUSÃO: O uso de RS diminui o número de UCH usadas, não é custo/efetivo e mostrou benefícios ao paciente.

INTRODUCTION: The use of cell saver (CS) in cardiac surgery is proposed to reduce the use of units of packed red blood cells stored (URBC), which increases morbidity, mortality and causes inflammatory reactions. OBJECTIVE: The objective is to evaluate whether the use of CS decreases the use URBC, is cost /effective and beneficial to the patient. METHODS: In a prospective study, between November 2009 and October 2011, 100 consecutive patients who underwent cardiovascular surgery with CPB, hemodilution and hemofiltration, were enrolled. Patients were divided into group 1 (no CS) and 2 (CS). The criteria for the replacement of RBC were hemodynamic instability and hemoglobin (Hb) <7-8g/dl. Demographic data, as well as Hb and hematocrit, mediastinal drainage, number of URBC and CPB, ICU and hospital time, were analysed. RESULTS: In groups 1 and 2 the average age was 64.1 and 60.6 years; predominantly male; the logistic EuroSCORE 10.3 and 9.4; mortality 2% and 4%. Group 2 had a higher incidence of reoperations (12% versus 6%), but the average of URBC used (4.31 versus 1.25) and mean length of hospital stay (10.8 versus 7.4 days) was lower. Univariate and multivariate analysis, were performed, which showed no statistically significant values, except in the use of URBC. The relationship between the CS and the cost of RBC was not cost /effective and length of stay was shorter. CONCLUSION: The use of CS decreases the number of used URBC, is not cost /effective but has shown benefits for patients.

Assuntos

RESUMO

PURPOSE: To compare the viability of human hepatocytes dissociated by the ethylenediaminetetraacetic acid and collagenase techniques. METHODS: Hepatocytes were prepared by dissociation of liver fragments obtained from hepatectomies performed for therapeutic purposes at the Service of Digestive Tract Surgery, Federal University of Triângulo Mineiro. RESULTS: During the first 4 days of the experiment, 70 percent of the cells presented birefringent membranes and were not stained with 2 percent erythrosine, and were therefore considered to be viable. During the first 3 days, hepatocyte viability was on average 71 percent in the EDTA group and 76 percent in the collagenase group, with no significant difference between groups. No significant difference was observed between groups at any time. The secretion of albumin by the cultured hepatocytes was preserved up to the seventh day. Mean albumin secretion during the first 3 days was 50 æg/ml in the two groups and a reduction of albumin production was observed from the fourth to the seventh day. Again, no significant difference was observed between groups at any time. CONCLUSION: Cell viability and preservation of albumin secretion by hepatocytes are similar for the EDTA and collagenase techniques.(AU)

OBJETIVO: Comparar a viabilidade dos hepatócitos humanos dissociados pelas técnicas do ácido etilenodiaminotetracético e da colagenase. MÉTODOS: Hepatócitos foram preparados pela dissociação de fragmentos de fígado, provenientes de hepatectomias realizadas com o objetivo terapêutico no Serviço de Cirurgia do Aparelho Digestivo da Universidade Federal do Triângulo Mineiro. RESULTADOS: Detectou-se que nos quatro primeiros dias de experimento 70 por cento das células estavam com suas membranas biorrefringentes e não se coravam pela eritrosina a 2 por cento portanto foram consideradas viáveis. Observou-se que nos três primeiros dias a viabilidade dos hepatócitos foi em média 71 por cento no grupo EDTA e 76 por cento na colagenase, diferença esta sem significado estatístico entre os grupos. Em nenhum momento, detectou-se diferença estatística entre os grupos. Com relação a preservação da secreção de albumina pelos hepatócitos em cultura observou-se que foi mantida até o sétimo dia. Da mesma forma, notou-se que nos três primeiros dias a média de secreção de albumina de ambos os grupos foi de 50 ìg/dl e que após o quarto dia verificou-se redução da produção até o sétimo dia. Também não foi observado diferença significativa em nenhum momento entre os grupos. CONCLUSÃO: A viabilidade celular e a preservação da função de secretar albumina pelos hepatócitos são semelhantes pelas técnica do EDTA e da colagenase.(AU)

Assuntos

RESUMO

PURPOSE: To compare the viability of human hepatocytes dissociated by the ethylenediaminetetraacetic acid and collagenase techniques. METHODS: Hepatocytes were prepared by dissociation of liver fragments obtained from hepatectomies performed for therapeutic purposes at the Service of Digestive Tract Surgery, Federal University of Triângulo Mineiro. RESULTS: During the first 4 days of the experiment, 70 percent of the cells presented birefringent membranes and were not stained with 2 percent erythrosine, and were therefore considered to be viable. During the first 3 days, hepatocyte viability was on average 71 percent in the EDTA group and 76 percent in the collagenase group, with no significant difference between groups. No significant difference was observed between groups at any time. The secretion of albumin by the cultured hepatocytes was preserved up to the seventh day. Mean albumin secretion during the first 3 days was 50 æg/ml in the two groups and a reduction of albumin production was observed from the fourth to the seventh day. Again, no significant difference was observed between groups at any time. CONCLUSION: Cell viability and preservation of albumin secretion by hepatocytes are similar for the EDTA and collagenase techniques.

OBJETIVO: Comparar a viabilidade dos hepatócitos humanos dissociados pelas técnicas do ácido etilenodiaminotetracético e da colagenase. MÉTODOS: Hepatócitos foram preparados pela dissociação de fragmentos de fígado, provenientes de hepatectomias realizadas com o objetivo terapêutico no Serviço de Cirurgia do Aparelho Digestivo da Universidade Federal do Triângulo Mineiro. RESULTADOS: Detectou-se que nos quatro primeiros dias de experimento 70 por cento das células estavam com suas membranas biorrefringentes e não se coravam pela eritrosina a 2 por cento portanto foram consideradas viáveis. Observou-se que nos três primeiros dias a viabilidade dos hepatócitos foi em média 71 por cento no grupo EDTA e 76 por cento na colagenase, diferença esta sem significado estatístico entre os grupos. Em nenhum momento, detectou-se diferença estatística entre os grupos. Com relação a preservação da secreção de albumina pelos hepatócitos em cultura observou-se que foi mantida até o sétimo dia. Da mesma forma, notou-se que nos três primeiros dias a média de secreção de albumina de ambos os grupos foi de 50 ìg/dl e que após o quarto dia verificou-se redução da produção até o sétimo dia. Também não foi observado diferença significativa em nenhum momento entre os grupos. CONCLUSÃO: A viabilidade celular e a preservação da função de secretar albumina pelos hepatócitos são semelhantes pelas técnica do EDTA e da colagenase.

Assuntos