RESUMO

O objetivo deste comunicado é desenvolver um método quantitativo PCR em tempo real, baseado em guia molecular (MB) (MB-qPCR) para detecção de infecção por espécies de Brucella, e avaliar seu potencial de utilização clínica. Os primers e as sondas MB foram desenhados para amplificação específica e determinação de sequência conservada do código do gene para os primeiros 58-aa da proteína de membrana externa OMP-2a, que é compartilhada em cinco espécies de Brucella epidêmicas. A avaliação metodológica foi realizada por análise de sensibilidade, especificidade, coeficiente de variação intra e inter, e a linearidade do qPCR. O potencial diagnóstico foi avaliado comparando-se o método qPCR desenvolvido com ensaios de exames bacteriológicos convencionais, incluindo os testes de soroaglutinação convencionais (SATs) e os testes do Rosa Bengala (RBPTs). O método exibiu alta sensibilidade (tão baixo quanto 50 cópias) e grande faixa de linearidade (102-108 cópias). Nenhuma reação cruzada foi encontrada com bactéria clínica comum. A sensibilidade diagnóstica foi superior ao exame bacteriológico, e a especificidade diagnóstica foi superior ao SAT ou ao RBPT. Um método MB-qPCR altamente sensível e específico para DNA de Brucella foi estabelecido com sucesso, provando ser uma ferramenta útil no diagnóstico molecular de brucelose.(AU)

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RESUMO

O objetivo deste comunicado é desenvolver um método quantitativo PCR em tempo real, baseado em guia molecular (MB) (MB-qPCR) para detecção de infecção por espécies de Brucella, e avaliar seu potencial de utilização clínica. Os primers e as sondas MB foram desenhados para amplificação específica e determinação de sequência conservada do código do gene para os primeiros 58-aa da proteína de membrana externa OMP-2a, que é compartilhada em cinco espécies de Brucella epidêmicas. A avaliação metodológica foi realizada por análise de sensibilidade, especificidade, coeficiente de variação intra e inter, e a linearidade do qPCR. O potencial diagnóstico foi avaliado comparando-se o método qPCR desenvolvido com ensaios de exames bacteriológicos convencionais, incluindo os testes de soroaglutinação convencionais (SATs) e os testes do Rosa Bengala (RBPTs). O método exibiu alta sensibilidade (tão baixo quanto 50 cópias) e grande faixa de linearidade (102-108 cópias). Nenhuma reação cruzada foi encontrada com bactéria clínica comum. A sensibilidade diagnóstica foi superior ao exame bacteriológico, e a especificidade diagnóstica foi superior ao SAT ou ao RBPT. Um método MB-qPCR altamente sensível e específico para DNA de Brucella foi estabelecido com sucesso, provando ser uma ferramenta útil no diagnóstico molecular de brucelose.(AU)

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Estudos moleculares ressaltam as limitações do protocolo endodôntico tradicional em eliminar bactérias dos canais radiculares. Apesar do preparo químico-cirúrgico (PQC) promover uma drástica redução bacteriana, muitos canais continuam infectados após essa etapa do tratamento. Dessa forma, estudos apontam para a necessidade de complementação técnica para potencializar a desinfecção dos canais radiculares após o PQC. Assim, o objetivo deste estudo clínico foi avaliar, por métodos moleculares baseados em DNA e RNA, o efeito dos métodos complementares ao preparo na desinfecção dos canais radiculares. Coletas microbiológicas dos canais de 20 dentes unirradiculares com periodontite apical foram feitas em diferentes etapas do tratamento endodôntico: previamente ao preparo (S1); após o PQC realizado com sistema Reciproc associado à irrigação com NaOCl 2,5% (S2); após a irrigação ultrassônica passiva, denominada PUI (S3); e após a medicação intracanal à base de hidróxido de cálcio (S4). As amostras foram submetidas à extração de DNA e RNA. O RNA foi submetido à reação de transcrição reversa (RT-PCR) para confecção da fita dupla de DNA complementar (cDNA). DNA e cDNA foram submetidos a reações de qPCR, com iniciadores universais para a região 16S rRNA do domínio Bacteria. A atividade metabólica das bactérias foi verificada através da relação entre os níveis de rRNA e rDNA determinados pelos ensaios de qPCR. Os dados foram analisados pelo teste de Wilcoxon para amostras pareadas (p < 0,05). As amostras S1 dos 20 casos apresentaram altos níveis de rDNA (mediana: 1,25 x 105, intervalo 1,83 x 104 - 9,2 x 106) e rRNA bacteriano (mediana: 5,47 x 105, intervalo 7,8 x 104 - 5,95 x 107). Dezessete canais (85%) apresentaram reações qPCR positivas para rDNA nas amostras pós-preparo (S2). A redução de rDNA após o preparo foi estatisticamente significativa (p = 0,0003), com mediana de 2,5 x 104 (intervalo 2,26 x 103 - 9,52 x 104) cópias de rDNA em S2. Por sua vez, os níveis de rRNA (mediana: 7,84 x 104, intervalo 2,91 x 103 - 1,09 x 106) foram maiores que os níveis de rDNA (p = 0,01), sugerindo que essas bactérias estavam metabolicamente ativas em S2. Após a PUI, o número de amostras S3 com resultados positivos para rDNA caiu para 12, representando uma redução significativa em relação às amostras S2 (p = 0,008). Além disso, a PUI promoveu uma redução significativa dos níveis de rDNA (mediana 2,94 x 103, intervalo 2,70 x 103 - 1,09 x 105) em relação à amostras S2 (p = 0,01). Na análise baseada em rRNA, os níveis em S3 (mediana: 03 x 104, intervalo 1,82 x 103 - 1,39 x 105) não apresentaram diferença significativa em comparação aos níveis de rDNA (p = 0,07), sugerindo que houve uma redução do metabolismo bacteriano após a PUI. Em S4, o número de casos positivos para rDNA bacteriano (n = 13) e os níveis de rDNA (mediana: 3,73 x 104, intervalo 1,98 x 103 - 3,21 x 105) foram ligeiramente maiores quando comparados aos valores das amostras S3, porém sem diferenças significativas. Entretanto, os níveis de rRNA (mediana: 1,08 x 105, intervalo 3,41 x 103 - 1,60 x 106) foram maiores que os de rDNA (p = 0,02) nas amostras S4, sugerindo que as bactérias retomaram sua atividade metabólica apesar do uso da medicação intracanal. Portanto, foi possível concluir que a irrigação ultrassônica passiva contribuiu para a desinfecção dos canais radiculares, promovendo uma redução do número e do metabolismo de bactérias. Por outro lado, as bactérias persistiram ativas nos canais radiculares após o uso do hidróxido de cálcio como medicação intracanal em dentes com periodontite apical.

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Os objetivos do presente estudo foram os de verificar a validade do método de reação em cadeia da polimerase em tempo real (qPCR) para detectar e quantificar o Staphylococcus aureus em amostras de leite conservadas com bronopol oriundas de quartos mamários bovinos subclinicamente infectados, e de avaliar os efeitos da presença e da quantidade de células da bactéria sobre a contagem de células somáticas (CCS), a composição do leite (lactose, gordura, proteína bruta, proteína verdadeira e caseína), e a produção de leite de quartos mamários bovinos subclinicamente infectados pelo patógeno. Para a quantificação do S. aureus e das células somáticas bovinas por meio do qPCR, foi utilizado leite cru bovino para o preparo dos padrões como meio de diluição da inoculação seriada de células somáticas e do S. aureus ATCC 29213, e construídas as equações log10UFC = 37,86 23,54 log10CtSAU e log10CCS = 49,3 - 34,0 log10CtBMCB, com base nos resultados obtidos pelas metodologias de referência para cada procedimento. Para testar a equivalência dessas equações aos respectivos métodos de referência, determinar a sensibilidade e especificidade analíticas e a repetibilidade do método proposto, foram coletadas amostras de leite dos quartos mamários de 60 animais de 2 rebanhos leiteiros da região de Pirassununga dos quais se determinou previamente a ocorrência de casos subclínicos de mastite por S. aureus. Dos quartos mamários também foram mensuradas as produções e coletadas amostras de leite para análise de composição, diagnóstico da mastite, e determinação da sensibilidade e especificidade diagnósticas do procedimento de qPCR estabelecido no estudo. Cada amostra foi submetida à análise de composição, CCS, cultura microbiológica, contagem em placas do S. aureus, processadas para a extração do DNA genômico bovino e do S. aureus, e submetida à reação de qPCR. Para análise da concordância entre os resultados obtidos pelos métodos de referência para o diagnóstico da mastite por S. aureus e o de qPCR foi utilizado o teste Kappa. Para avaliação da equivalência das contagens obtidas pelos métodos de referência do S. aureus e de células somáticas bovinas, foi utilizado o teste das diferenças de Bland-Altman. Para a identificação do efeito da infecção subclínica pelo S. aureus sobre a composição e produção de leite do quarto mamário afetado foi utilizada a análise da variância num delineamento em parcelas subdivididas em faixas. Para estimar o grau de relação entre as contagens de S. aureus, a CCS, produção e composição do leite produzido pelo quarto mamário afetado foi utilizado o coeficiente de correlação de Pearson. A correlação entre os resultados de contagem de células somáticas bovinas determinados pelos métodos de rotina e de qPCR para a quantificação de células somáticas apresentou coeficiente r = - 0,978 (P < 0,001). ...

The objectives of this study were to verify the validity of the real-time polymerase chain reaction (qPCR) to detect and quantify Staphylococcus aureus in bronopol-preserved milk samples from subclinically infected mammary quarters, and to assess the effects of the presence and amount of the pathogen on the somatic cell count (SCC), the composition of milk and milk yield of bovine mammary quarters subclinically infected by the pathogen. In order to quantify S. aureus and bovine somatic cells through qPCR, raw bovine milk was used as a means of serial inoculation media of somatic cells and S. aureus ATCC 29213. From that, equations based on the reference methods for each procedure were built, log10UFC = 37,86 23,54 log10CtSAU and log10CCS = 49,3 - 34,0 log10CtBMCB, respectively. To test their equivalence with the reference methods, determine the analytical sensitivity and specificity, and repeatability of the proposed method, milk was sampled from quarters of 60 animals from two dairy herds in Pirassununga, where subclinical S. aureus mastitis cases had been previously diagnosed. Also, quarter milk yield had been measured and samples collected for milk composition analysis, diagnosis of mastitis, sensitivity and specificity of the procedure established in the study had been determined. Each sample was subjected to composition analysis, SCC, microbiological culture, plate counting of S. aureus, DNA extraction, and subjected to qPCR reaction. Agreement between results from reference methods and qPCR for the diagnosis of mastitis by S. aureus was assessed by Kappa test. Equivalence between S. aureus, SCC scores obtained by reference and qPCR was assessed with Bland-Altman procedures. The effect of S. aureus subclinical infection on milk composition and milk yield of affected quarters was measured using a strip plot design. To estimate the degree of relationship between the counts of S. aureus, SCC, yield and composition of the milk from affected quarters was assessed by the Pearson Correlation. Correlation between SCC determined by routine methods and qPCR was r = - 0.978 (P <0.001). Correlation between S. aureus ATCC 29213 determined by routine methods and qPCR was r = - 0.989 (P <0.001). Analytical specificity of qPCR to detect S. aureus in milk samples against Escherichia coli, Enterococcus sp., Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus agalactiae, Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus uberis, coagulase-negative staphylococci and coagulase-positive species, Staphylococcus hyicus and Staphylococcus intermedius was 100%. The use of the qPCR to detect S. aureus ATCC 29213 in milk samples is replicable. Analytical sensitivity detection limit of the method ranged from 10 CFU/mL to 4.2 x 106 CFU/mL. S. aureus could be detected, but not quantified by qPCR in bronopol-conserved milk samples from subclin...

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O Vírus da leucemia felina (FeLV) pertence à família Retroviridae, gênero Gammaretrovirus. Diferentemente de outras retroviroses, uma parcela dos gatos jovens e adultos exposta ao FeLV não apresenta antigenemia/viremia, de acordo com as técnicas convencionais de detecção viral, como isolamento em cultivo celular, imunofluorescência direta e ELISA. O emprego de técnicas de maior sensibilidade para detecção e quantificação viral, como o PCR quantitativo, permitiu a identificação de animais positivos para a presença de DNA proviral e RNA na ausência de antigenemia/viremia e, com isso, um refinamento da análise das diferentes evoluções da infecção. Assim, reclassificou-se a patogenia do FeLV em 4 categorias: infecção abortiva, regressiva, latente e progressiva. Foi possível também detectar DNA proviral e RNA em animais considerados imunes ao FeLV após vacinação. Diante disso, os objetivos desta revisão de literatura foram demonstrar as implicações da utilização de técnicas sensíveis de detecção viral na interpretação e classificação da infecção do FeLV e rever as técnicas de detecção do vírus para fins de diagnóstico. Além disso, apresentar os resultados referentes à eficácia da vacinação contra o FeLV com a utilização dessas técnicas.

Feline leukemia virus (FeLV) belongs to the Retroviridae family, genus Gammaretrovirus. Unlike other retroviruses, a portion of FeLV exposed animals eliminates antigenemia/viremia, according to convectional techniques of virus detection, such as isolation in cell culture, direct fluorescent antibody test and ELISA. The use of more sensitive techniques to detect and quantify viruses enabled the detection of proviral DNA and RNA in cats with undetectable antigenemia/viremia, and thus the refinement of the different infection outcomes analysis. As a result, FeLV pathogenesis was reclassified in 4 categories: abortive, regressive, latent and progressive infections. It was also demonstrated the detection of proviral DNA and RNA in cats believed to be immune to infection after vaccination. Therefore, the objectives of this review were to demonstrate the implications of the use of sensitive techniques for viral detection in the interpretation and classification of FeLV infection and reconsider the techniques for FeLV diagnostic purposes. In addition, it was presented the results concerning the effectiveness of FeLV vaccination with the use of these techniques.

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Feline leukemia virus (FeLV) belongs to the Retroviridae family, genus Gammaretrovirus. Unlike other retroviruses, a portion of FeLV exposed animals eliminates antigenemia/viremia, according to convectional techniques of virus detection, such as isolation in cell culture, direct fluorescent antibody test and ELISA. The use of more sensitive techniques to detect and quantify viruses enabled the detection of proviral DNA and RNA in cats with undetectable antigenemia/viremia, and thus the refinement of the different infection outcomes analysis. As a result, FeLV pathogenesis was reclassified in 4 categories: abortive, regressive, latent and progressive infections. It was also demonstrated the detection of proviral DNA and RNA in cats believed to be immune to infection after vaccination. Therefore, the objectives of this review were to demonstrate the implications of the use of sensitive techniques for viral detection in the interpretation and classification of FeLV infection and reconsider the techniques for FeLV diagnostic purposes. In addition, it was presented the results concerning the effectiveness of FeLV vaccination with the use of these techniques.

O Vírus da leucemia felina (FeLV) pertence à família Retroviridae, gênero Gammaretrovirus. Diferentemente de outras retroviroses, uma parcela dos gatos jovens e adultos exposta ao FeLV não apresenta antigenemia/viremia, de acordo com as técnicas convencionais de detecção viral, como isolamento em cultivo celular, imunofluorescência direta e ELISA. O emprego de técnicas de maior sensibilidade para detecção e quantificação viral, como o PCR quantitativo, permitiu a identificação de animais positivos para a presença de DNA proviral e RNA na ausência de antigenemia/viremia e, com isso, um refinamento da análise das diferentes evoluções da infecção. Assim, reclassificou-se a patogenia do FeLV em 4 categorias: infecção abortiva, regressiva, latente e progressiva. Foi possível também detectar DNA proviral e RNA em animais considerados imunes ao FeLV após vacinação. Diante disso, os objetivos desta revisão de literatura foram demonstrar as implicações da utilização de técnicas sensíveis de detecção viral na interpretação e classificação da infecção do FeLV e rever as técnicas de detecção do vírus para fins de diagnóstico. Além disso, apresentar os resultados referentes à eficácia da vacinação contra o FeLV com a utilização dessas técnicas.

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Feline leukemia virus (FeLV) belongs to the Retroviridae family, genus Gammaretrovirus. Unlike other retroviruses, a portion of FeLV exposed animals eliminates antigenemia/viremia, according to convectional techniques of virus detection, such as isolation in cell culture, direct fluorescent antibody test and ELISA. The use of more sensitive techniques to detect and quantify viruses enabled the detection of proviral DNA and RNA in cats with undetectable antigenemia/viremia, and thus the refinement of the different infection outcomes analysis. As a result, FeLV pathogenesis was reclassified in 4 categories: abortive, regressive, latent and progressive infections. It was also demonstrated the detection of proviral DNA and RNA in cats believed to be immune to infection after vaccination. Therefore, the objectives of this review were to demonstrate the implications of the use of sensitive techniques for viral detection in the interpretation and classification of FeLV infection and reconsider the techniques for FeLV diagnostic purposes. In addition, it was presented the results concerning the effectiveness of FeLV vaccination with the use of these techniques.

O Vírus da leucemia felina (FeLV) pertence à família Retroviridae, gênero Gammaretrovirus. Diferentemente de outras retroviroses, uma parcela dos gatos jovens e adultos exposta ao FeLV não apresenta antigenemia/viremia, de acordo com as técnicas convencionais de detecção viral, como isolamento em cultivo celular, imunofluorescência direta e ELISA. O emprego de técnicas de maior sensibilidade para detecção e quantificação viral, como o PCR quantitativo, permitiu a identificação de animais positivos para a presença de DNA proviral e RNA na ausência de antigenemia/viremia e, com isso, um refinamento da análise das diferentes evoluções da infecção. Assim, reclassificou-se a patogenia do FeLV em 4 categorias: infecção abortiva, regressiva, latente e progressiva. Foi possível também detectar DNA proviral e RNA em animais considerados imunes ao FeLV após vacinação. Diante disso, os objetivos desta revisão de literatura foram demonstrar as implicações da utilização de técnicas sensíveis de detecção viral na interpretação e classificação da infecção do FeLV e rever as técnicas de detecção do vírus para fins de diagnóstico. Além disso, apresentar os resultados referentes à eficácia da vacinação contra o FeLV com a utilização dessas técnicas.

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Nos últimos dez anos, o tratamento da leucemia mielóide crônica (LMC) passou por uma grande mudança com a introdução da terapia alvo, onde o mesilato de imatinibe (MI) atua inibindo a atividade tirosina quinase do transcrito BCR-ABL produto este do cromossomo Filadélfia (Ph). Esta revolução terapêutica obrigou que técnicas moleculares, até então de uso restrito na oncohematologia, como a reação em cadeia da polimerase em tempo real (RQ-PCR), fossem necessárias para monitorar o sucesso terapêutico ou a detecção precoce da perda de resposta ao MI. Nesta revisão estão delineados, de forma resumida, os principais procedimentos quanto à monitoração dos pacientes com LMC em tratamento com o MI segundo o Consenso Brasileiro de LMC.

Treatment of chronic myeloid leukemia (CML) has changed since the introduction of imatinib mesylate (IM) 10 years ago. IM acts as a target therapy against the BCR-ABL gene by inhibiting its tyrosine kinase activity. This revolution in treating CML compels the introduction of molecular techniques, such as real time quantitative polymerase chain reaction (RQ-PCR) to monitor the response to IM by providing an accurate measurement of the degree to which the BCR-ABL transcript is reduced or an early detection of loss of response identified by a rising level of BCR-ABL. In this review, we summarize the Brazilian CML consensus regarding the main procedures used to monitor CML patients treated with IM.

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