RESUMO
Rat liver histidase was expressed in E. coli by using a PCR product of the coding sequence obtained from the rat liver cDNA of histidase cloned in the expression vector pRSET. The construct (pRSET-HAL) produced a fusion protein containing a tail of polyhistidine. The expression product was purified with a resin containing Ni+ that retains proteins with polyhistidine fragments. pRSET-HAL was analyzed by restriction enzyme mapping and by sequencing confirming the correct orientation and nucleotide sequence. Native rat liver histidase was also purified and it had a Mr of 72 kDa. An antiserum against native histidase was obtained in rabbit. Western blot analysis revealed one band of 72 kDa observed in membranes containing purified histidase or rat liver high speed supernatants. The same antiserum also detected in cell lysates of E. coli transformed with the pRSET-HAL plasmid a single band of 74 kDa of the recombinant histidase before cleavage with enterokinase. After the proteolysis, the Western blot analysis showed a single band of approximately 72 kDa. Kinetic analysis of the recombinant histidase showed similar Km and Vmax compared with native histidase.
La histidasa de hígado de rata se expresó a partir del producto de amplificación por PCR de la región codificante del DNAc de la histidasa, el cual se clonó en el vector de expresión pRSET. La construcción (pRSET-HAL) permitió la producción de una proteína de fusión que contenía una cola de polihistidinas. El producto de expresión se purificó con una resina que contiene Ni+, la cual retiene proteínas con fragmentos de polihistidina. El pRSET-HAL se analizó por medio de un análisis con enzimas de restricción y por secuenciación de DNA para confirmar su correcta orientación así como tambièn su secuencia nucleotídica. La histidasa nativa hepática fue tambièn purificada y tuvo un Mr de 72 kDa. A partir de la enzima purificada nativa se preparó un antisuero contra la histidasa en conejo. El análisis por Western blot mostró una sola banda de 72 kDa en membranas que contenían histidasa purificada o en la fracción citosólica de hígado de rata. El mismo anticuerpo tambièn detectó en lisados de E. coli transformados con el plásmido pRSET-HAL una sola banda de 74 kDa correspondientes a la histidasa recombinante antes de su hidrólisis con enterocinasa. Despuès de la proteólisis, el análisis por Western blot mostró una sola banda de aproximadamente 72 kDa correspondiente a la histidasa. Análisis cinèticos de la histidasa recombinante mostraron Km y Vmax similares a las observadas con la histidasa nativa.