RESUMO

Vegetables are an important source of income and high-value crops for small farmers. Chilli (Capsicum spp.) is one of the most economically important vegetables of Pakistan and it is grown throughout the country. It is a rich source of nutrition especially vitamins A, B, C and E along with minerals as folic acid, manganese (Mn), potassium (K) and molybdenum (Mo). Chilli possesses seven times more amount of vitamin C than an orange. Vitamin A, C and beta carotenoids are strong antioxidants to scavenge the free radicals. Chilli production is restricted due to various biotic factors. Among these viruses, Chilli veinal mottle virus (ChiVMV) is one of the most destructive and menacing agents that inflicts heavy and colossal losses that accounted for 50% yield loss both in quality and quantity. Pathogen-Derived Resistance (PDR) approach is considered one of the effective approaches to manage plant viruses. In this study, ChiVMV was characterized on a molecular level, the coat protein (CP) gene of the virus was stably transformed into Nicotiana benthamiana plants using Agrobacterium tumefaciens. The transgenic plants were challenged with the virus to evaluate the level of resistance of plants against the virus. It was observed that the plants expressing CP gene have partial resistance against the virus in terms of symptoms' development and virus accumulation. Translation of this technique into elite chilli varieties will be resulted to mitigate the ChiVMV in the crop as well as an economic benefit to the farmers.

Vegetais são uma importante fonte de renda e culturas de alto valor para os pequenos agricultores. A pimenta-malagueta (Capsicum spp.) é uma das hortaliças mais importantes economicamente do Paquistão e é cultivada em todo o país. É uma rica fonte de nutrição, especialmente vitaminas A, B, C e E com minerais como ácido fólico, manganês (Mn), potássio (K) e molibdênio (Mo). O pimentão possui sete vezes mais vitamina C do que a laranja. Vitaminas A e C e betacarotenoides são antioxidantes fortes para eliminar os radicais livres. A produção de pimenta é restrita devido a vários fatores bióticos. Entre esses vírus, o ChiVMV é o agente mais destrutivo e ameaçador que inflige perdas pesadas e colossais que representam 50% da perda de rendimento, tanto em qualidade quanto em quantidade. A abordagem de resistência derivada de patógenos (PDR) é considerada uma das abordagens eficazes para gerenciar os vírus de plantas. Neste estudo, ChiVMV foi caracterizado em nível molecular e o gene CP do vírus foi transformado de forma estável em plantas Nicotiana benthamiana usando Agrobacterium tumefaciens. As plantas transgênicas foram desafiadas com o vírus para avaliar seu nível de resistência contra o vírus. Observou-se que as plantas que expressam o gene CP apresentam resistência parcial ao vírus em termos de desenvolvimento de sintomas e acúmulo de vírus. A tradução dessa técnica em variedades de pimenta de elite resultará na mitigação do ChiVMV na safra, bem como em benefícios econômicos para os agricultores em termos de melhor rendimento e baixo custo de produção.

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RESUMO

Abstract Vegetables are an important source of income and high-value crops for small farmers. Chilli (Capsicum spp.) is one of the most economically important vegetables of Pakistan and it is grown throughout the country. It is a rich source of nutrition especially vitamins A, B, C and E along with minerals as folic acid, manganese (Mn), potassium (K) and molybdenum (Mo). Chilli possesses seven times more amount of vitamin C than an orange. Vitamin A, C and beta-carotenoids are strong antioxidants to scavenge the free radicals. Chilli production is restricted due to various biotic factors. Among these viruses, Chilli veinal mottle virus (ChiVMV) is one of the most destructive and menacing agents that inflicts heavy and colossal losses that accounted for 50% yield loss both in quality and quantity. Pathogen-Derived Resistance (PDR) approach is considered one of the effective approaches to manage plant viruses. In this study, ChiVMV was characterized on a molecular level, the coat protein (CP) gene of the virus was stably transformed into Nicotiana benthamiana plants using Agrobacterium tumefaciens. The transgenic plants were challenged with the virus to evaluate the level of resistance of plants against the virus. It was observed that the plants expressing CP gene have partial resistance against the virus in terms of symptoms development and virus accumulation. Translation of this technique into elite chilli varieties will be resulted to mitigate the ChiVMV in the crop as well as an economic benefit to the farmers.

Resumo Vegetais são uma importante fonte de renda e culturas de alto valor para os pequenos agricultores. A pimenta-malagueta (Capsicum spp.) é uma das hortaliças mais importantes economicamente do Paquistão e é cultivada em todo o país. É uma rica fonte de nutrição, especialmente vitaminas A, B, C e E com minerais como ácido fólico, manganês (Mn), potássio (K) e molibdênio (Mo). O pimentão possui sete vezes mais vitamina C do que a laranja. Vitaminas A e C e betacarotenoides são antioxidantes fortes para eliminar os radicais livres. A produção de pimenta é restrita devido a vários fatores bióticos. Entre esses vírus, o ChiVMV é o agente mais destrutivo e ameaçador que inflige perdas pesadas e colossais que representam 50% da perda de rendimento, tanto em qualidade quanto em quantidade. A abordagem de resistência derivada de patógenos (PDR) é considerada uma das abordagens eficazes para gerenciar os vírus de plantas. Neste estudo, ChiVMV foi caracterizado em nível molecular e o gene CP do vírus foi transformado de forma estável em plantas Nicotiana benthamiana usando Agrobacterium tumefaciens. As plantas transgênicas foram desafiadas com o vírus para avaliar seu nível de resistência contra o vírus. Observou-se que as plantas que expressam o gene CP apresentam resistência parcial ao vírus em termos de desenvolvimento de sintomas e acúmulo de vírus. A tradução dessa técnica em variedades de pimenta de elite resultará na mitigação do ChiVMV na safra, bem como em benefícios econômicos para os agricultores em termos de melhor rendimento e baixo custo de produção.

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Vegetables are an important source of income and high-value crops for small farmers. Chilli (Capsicum spp.) is one of the most economically important vegetables of Pakistan and it is grown throughout the country. It is a rich source of nutrition especially vitamins A, B, C and E along with minerals as folic acid, manganese (Mn), potassium (K) and molybdenum (Mo). Chilli possesses seven times more amount of vitamin C than an orange. Vitamin A, C and beta carotenoids are strong antioxidants to scavenge the free radicals. Chilli production is restricted due to various biotic factors. Among these viruses, Chilli veinal mottle virus (ChiVMV) is one of the most destructive and menacing agents that inflicts heavy and colossal losses that accounted for 50% yield loss both in quality and quantity. Pathogen-Derived Resistance (PDR) approach is considered one of the effective approaches to manage plant viruses. In this study, ChiVMV was characterized on a molecular level, the coat protein (CP) gene of the virus was stably transformed into Nicotiana benthamiana plants using Agrobacterium tumefaciens. The transgenic plants were challenged with the virus to evaluate the level of resistance of plants against the virus. It was observed that the plants expressing CP gene have partial resistance against the virus in terms of symptoms' development and virus accumulation. Translation of this technique into elite chilli varieties will be resulted to mitigate the ChiVMV in the crop as well as an economic benefit to the farmers.(AU)

Vegetais são uma importante fonte de renda e culturas de alto valor para os pequenos agricultores. A pimenta-malagueta (Capsicum spp.) é uma das hortaliças mais importantes economicamente do Paquistão e é cultivada em todo o país. É uma rica fonte de nutrição, especialmente vitaminas A, B, C e E com minerais como ácido fólico, manganês (Mn), potássio (K) e molibdênio (Mo). O pimentão possui sete vezes mais vitamina C do que a laranja. Vitaminas A e C e betacarotenoides são antioxidantes fortes para eliminar os radicais livres. A produção de pimenta é restrita devido a vários fatores bióticos. Entre esses vírus, o ChiVMV é o agente mais destrutivo e ameaçador que inflige perdas pesadas e colossais que representam 50% da perda de rendimento, tanto em qualidade quanto em quantidade. A abordagem de resistência derivada de patógenos (PDR) é considerada uma das abordagens eficazes para gerenciar os vírus de plantas. Neste estudo, ChiVMV foi caracterizado em nível molecular e o gene CP do vírus foi transformado de forma estável em plantas Nicotiana benthamiana usando Agrobacterium tumefaciens. As plantas transgênicas foram desafiadas com o vírus para avaliar seu nível de resistência contra o vírus. Observou-se que as plantas que expressam o gene CP apresentam resistência parcial ao vírus em termos de desenvolvimento de sintomas e acúmulo de vírus. A tradução dessa técnica em variedades de pimenta de elite resultará na mitigação do ChiVMV na safra, bem como em benefícios econômicos para os agricultores em termos de melhor rendimento e baixo custo de produção.(AU)

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Vegetables are an important source of income and high-value crops for small farmers. Chilli (Capsicum spp.) is one of the most economically important vegetables of Pakistan and it is grown throughout the country. It is a rich source of nutrition especially vitamins A, B, C and E along with minerals as folic acid, manganese (Mn), potassium (K) and molybdenum (Mo). Chilli possesses seven times more amount of vitamin C than an orange. Vitamin A, C and betacarotenoids are strong antioxidants to scavenge the free radicals. Chilli production is restricted due to various biotic factors. Among these viruses, Chilli veinal mottle virus (ChiVMV) is one of the most destructive and menacing agents that inflicts heavy and colossal losses that accounted for 50% yield loss both in quality and quantity. Pathogen-Derived Resistance (PDR) approach is considered one of the effective approaches to manage plant viruses. In this study, ChiVMV was characterized on a molecular level, the coat protein (CP) gene of the virus was stably transformed into Nicotiana benthamiana plants using Agrobacterium tumefaciens. The transgenic plants were challenged with the virus to evaluate the level of resistance of plants against the virus. It was observed that the plants expressing CP gene have partial resistance against the virus in terms of symptoms' development and virus accumulation. Translation of this technique into elite chilli varieties will be resulted to mitigate the ChiVMV in the crop as well as an economic benefit to the farmers.

Vegetais são uma importante fonte de renda e culturas de alto valor para os pequenos agricultores. A pimenta-malagueta (Capsicum spp.) é uma das hortaliças mais importantes economicamente do Paquistão e é cultivada em todo o país. É uma rica fonte de nutrição, especialmente vitaminas A, B, C e E com minerais como ácido fólico, manganês (Mn), potássio (K) e molibdênio (Mo). O pimentão possui sete vezes mais vitamina C do que a laranja. Vitaminas A e C e betacarotenoides são antioxidantes fortes para eliminar os radicais livres. A produção de pimenta é restrita devido a vários fatores bióticos. Entre esses vírus, o ChiVMV é o agente mais destrutivo e ameaçador que inflige perdas pesadas e colossais que representam 50% da perda de rendimento, tanto em qualidade quanto em quantidade. A abordagem de resistência derivada de patógenos (PDR) é considerada uma das abordagens eficazes para gerenciar os vírus de plantas. Neste estudo, ChiVMV foi caracterizado em nível molecular e o gene CP do vírus foi transformado de forma estável em plantas Nicotiana benthamiana usando Agrobacterium tumefaciens. As plantas transgênicas foram desafiadas com o vírus para avaliar seu nível de resistência contra o vírus. Observou-se que as plantas que expressam o gene CP apresentam resistência parcial ao vírus em termos de desenvolvimento de sintomas e acúmulo de vírus. A tradução dessa técnica em variedades de pimenta de elite resultará na mitigação do ChiVMV na safra, bem como em benefícios econômicos para os agricultores em termos de melhor rendimento e baixo custo de produção.

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RESUMO

The target cp1002_RS01850 from Corynebacterium pseudotuberculosis was used to construct a DNA and recombinant subunit vaccine against caseous lymphadenitis. Recombinant protein rCP01850 was expressed in Escherichia coli using pAE vector, and DNA vaccine was engineered with pTARGET vector. BALB/c mice were divided in five groups containing eight animals each, inoculated with: pTARGET/cp01850 as DNA vaccine (G1); rCP01850 plus Al (OH)3 as recombinant subunit vaccine (G2); pTARGET/cp01850 and a boost with rCP01850 plus Al (OH)3 (G3); pTARGET (G4); or Al (OH)3 (G5). Mice were inoculated and blood samples were collected on days 0, 21, and 42 for the analysis of total IgG, IgG1 and IgG2a by ELISA. In each group, five animals were challenged with Mic-6 C. pseudotuberculosis strain, and three were used for cytokine quantification by qPCR. Although no group has been protected by vaccines against lethal challenge, G2 showed an increase in the survival rate after challenge. Significantly higher levels of IL-4, IL-12, IFN-γ, total IgG, IgG1 and IgG2a were also detected for G2, evidencing a mixed Th1/Th2 immunological profile. In conclusion, despite no protection level provided by different vaccinal strategies using cp1002_RS01850 from C. pseudotuberculosis, G2 developed a Th1/Th2 immune response with an increase in survival rate.(AU)

O alvo cp1002_RS01850 de Corynebacterium pseudotuberculosis foi utilizado para construir uma vacina recombinante de subunidade e de DNA contra a linfadenite caseosa. A proteína recombinante rCP01850 foi expressa em Escherichia coli usando o vetor pAE, e a vacina de DNA foi construída com o vetor pTARGET. Camundongos BALB/c foram divididos em grupos de oito animais, inoculados com: pTARGET/cp01850 como vacina de DNA (G1); rCP01850 e Al (OH)3 como vacina recombinante de subunidade (G2); pTARGET/cp01850 e um boost com rCP01850 e Al (OH)3 (G3); pTARGET (G4); ou Al (OH)3 (G5). Os animais foram inoculados e amostras de sangue foram coletadas nos dias 0, 21, e 42 do experimento para a análise de IgG total, IgG1 e IgG2a por ELISA. De cada grupo, cinco animais foram desafiados com a cepa Mic-6 de C. pseudotuberculosis, e três foram usados para a quantificação de citocinas por qPCR. Apesar de nenhum grupo ter sido protegido pelas vacinas testadas contra o desafio letal, G2 apresentou taxa de sobrevida e níveis de IL-4, IL-12, IFN-γ, IgG total, IgG1 e IgG2a significativamente mais altos, evidenciando um perfil imunológico misto Th1/Th2. Conclui-se que apesar das diferentes estratégias vacinais utilizando cp1002_RS01850 de C. pseudotuberculosis não terem sido capazes de gerar proteção, G2 desenvolveu uma resposta Th1/Th2 e elevou a taxa de sobrevida.(AU)

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The target cp1002_RS01850 from Corynebacterium pseudotuberculosis was used to construct a DNA and recombinant subunit vaccine against caseous lymphadenitis. Recombinant protein rCP01850 was expressed in Escherichia coli using pAE vector, and DNA vaccine was engineered with pTARGET vector. BALB/c mice were divided in five groups containing eight animals each, inoculated with: pTARGET/cp01850 as DNA vaccine (G1); rCP01850 plus Al (OH)3 as recombinant subunit vaccine (G2); pTARGET/cp01850 and a boost with rCP01850 plus Al (OH)3 (G3); pTARGET (G4); or Al (OH)3 (G5). Mice were inoculated and blood samples were collected on days 0, 21, and 42 for the analysis of total IgG, IgG1 and IgG2a by ELISA. In each group, five animals were challenged with Mic-6 C. pseudotuberculosis strain, and three were used for cytokine quantification by qPCR. Although no group has been protected by vaccines against lethal challenge, G2 showed an increase in the survival rate after challenge. Significantly higher levels of IL-4, IL-12, IFN-γ, total IgG, IgG1 and IgG2a were also detected for G2, evidencing a mixed Th1/Th2 immunological profile. In conclusion, despite no protection level provided by different vaccinal strategies using cp1002_RS01850 from C. pseudotuberculosis, G2 developed a Th1/Th2 immune response with an increase in survival rate.(AU)

O alvo cp1002_RS01850 de Corynebacterium pseudotuberculosis foi utilizado para construir uma vacina recombinante de subunidade e de DNA contra a linfadenite caseosa. A proteína recombinante rCP01850 foi expressa em Escherichia coli usando o vetor pAE, e a vacina de DNA foi construída com o vetor pTARGET. Camundongos BALB/c foram divididos em grupos de oito animais, inoculados com: pTARGET/cp01850 como vacina de DNA (G1); rCP01850 e Al (OH)3 como vacina recombinante de subunidade (G2); pTARGET/cp01850 e um boost com rCP01850 e Al (OH)3 (G3); pTARGET (G4); ou Al (OH)3 (G5). Os animais foram inoculados e amostras de sangue foram coletadas nos dias 0, 21, e 42 do experimento para a análise de IgG total, IgG1 e IgG2a por ELISA. De cada grupo, cinco animais foram desafiados com a cepa Mic-6 de C. pseudotuberculosis, e três foram usados para a quantificação de citocinas por qPCR. Apesar de nenhum grupo ter sido protegido pelas vacinas testadas contra o desafio letal, G2 apresentou taxa de sobrevida e níveis de IL-4, IL-12, IFN-γ, IgG total, IgG1 e IgG2a significativamente mais altos, evidenciando um perfil imunológico misto Th1/Th2. Conclui-se que apesar das diferentes estratégias vacinais utilizando cp1002_RS01850 de C. pseudotuberculosis não terem sido capazes de gerar proteção, G2 desenvolveu uma resposta Th1/Th2 e elevou a taxa de sobrevida.(AU)

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The constant presence of genetically modified (GM) soybean in conventional seed lots has become a growing problem for international seed trade. In this context, seed companies have prompted the development of routine tests for accurate genetically modified soybean seeds detection. In this study, a quantitative PCR-based method was standardized in order to detect and quantify mixtures of seeds (i.e. certified seed) or GM grains (i.e. seeds came from field) into samples of non-GM soybean, in a way that soybean lots can be assessed within the standards established by legislation. The method involved the use of p35S-f2/petu-r1 primers targeting CP-4 enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase (cp4-epsps) gene (i.e. that confers herbicide tolerance in Roundup ReadyTM (RR)) for real-time PCR detection and quantification through mericon Quant GMO Detection Assay. The results revealed the method efficiency to detect and quantify the presence of even one soybean seed in batch used for routine evaluation of GM seeds. In addition, it was possible to detect of up to 0.1% of transgenic DNA relative to the soybean grains content. Thus, the sensitive GMO quantitative approach described in this study will provide support in supervising activities, and facilitate the process and control of GM soybean.

A constante presença da soja geneticamente modificada (GM) em lotes de sementes convencionais têm se tornado um grande problema para o comércio internacional de sementes. Neste contexto, as empresas de sementes estão em busca de testes de rotina extremamente precisos para a detecção de sementes de soja geneticamente modificadas. Neste estudo, um método baseado em PCR quantitativo foi padronizado para detectar e quantificar misturas de sementes (i.e. sementes certificadas) ou grãos geneticamente modificados (i.e. sementes oriundas do campo) dentro de lotes de soja não transgênica, de um modo que os lotes de soja possam ser avaliados dentro dos parâmetros estabelecidos pela legislação. O método envolveu o uso dos iniciadores p35S-f2/petu-r1 alvejando o gene CP-4 5-nolpiruvil-shikimato-3-fosfato sintase (cp4-epsps) (i.e. que confere a tolerância ao herbicida Roundup Ready® (RR)) para detecção e quantificação em PCR de tempo real via Ensaio de detecção Mericon Quant GMO. Os resultados revelaram um método eficiente para detectar e quantificar a presença de até mesmo uma única semente de soja no lote usado para a avaliação de rotina de sementes geneticamente modificadas. Adicionalmente, foi possível detectar até 0,1% de DNA transgênico relativo ao conteúdo de grãos de soja. Dessa forma, uma abordagem quantitativa sensível à soja geneticamente modificada foi descrita nesse estudo e poderá fornecer suporte em atividades de supervisão, além de facilitar o processo de controle da soja geneticamente modificada.

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