RESUMO

Objetivoaplicar metodologias práticas de biologia no ensino médio em escola estadual de Feira de Santana do período noturno, utilizando a biotecnologia com intuito de proporcionar novas experiências didáticas para jovens e adultos. Método: A abordagem metodológica é de modo qualitativo e descritivo através de relato de experiência, com aplicação de aula prática com materiais de baixo custo sobre a extração de DNA.Resultados: Com relação às dificuldades enfrentadas na Educação Básica, esta forma de metodologia do trabalho realizado mostrou-se produtiva, uma vez que possibilitou um espaço para discussão e troca de experiências dos alunos associando com seu cotidiano. Conclusão: Esta pesquisa mostrou que o uso desta abordagem didática facilitou o entendimento dos conteúdos trabalhados e do diálogo aluno-professor, evidenciando-a como uma ótima ferramenta para ser trabalhada na sala de aula

Objective: to apply practical biology methodologies in high school at a state school in Feira de Santana at night, using biotechnology with the aim of providing new teaching experiences for young people and adults. Methods:The methodological approach is qualitative and descriptive through experience reports, with the application of practical classes with low-cost materials on DNA extraction. Results: In relation to the difficulties faced in Basic Education, this form of work methodology proved to be productive, as itprovided a space for discussion and exchange of students' experiences associated with their daily lives. Conclusion:This research showed that the use of this didactic approach facilitated the understanding of the content covered and the student-teacher dialogue, highlighting it as a great tool to be used in the classroom

Objetivo: aplicar metodologías prácticas de biología en la escuela secundaria en una escuela pública de Feira de Santana en horario nocturno, utilizando la biotecnología con el objetivo de brindar nuevas experiencias de enseñanza a jóvenes y adultos. Métodos: El enfoque metodológico es cualitativo y descriptivo a través de relatos de experiencia, con la aplicación de clases prácticas con materiales de bajo costo sobre extracción de ADN. Resultados: En relación a las dificultades enfrentadas en la Educación Básica, esta forma de metodología de trabajo resultó productiva, ya que brindó un espacio de discusión e intercambio de experiencias de los estudiantes asociadas a su vida cotidiana. Conclusión: Esta investigación demostró que el uso de este enfoque didáctico facilitó la comprensión de los contenidos tratados y el diálogo alumno-profesor, destacándolo como una gran herramienta para ser utilizado en el aula.

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Abstract The principle and the techniques applied in DNA extraction play a pivotal role in the obtention of a purified genetic material. The present study investigates the efficiency of eight protocols in the DNA extraction of Hypostomus commersoni, an essential component of South American freshwater ichthyofauna. The quality of samples was assessed through spectrophotometry, gel electrophoresis, and PCR-RAPD markers amplification. The efficiency of DNA extraction was influenced both by the method applied and the target-tissue of choice. Higher concentrations and yield of DNA were obtained from ocular tissue, with a positive spectrum of incubation in lysis buffer for up to 36 hours after sample collection, using fresh tissues and in the presence of a high concentration of Proteinase K (20 mg.ml-1). In these conditions, samples were successfully amplified. To date, there is no record of description for the parameters analyzed in this work, neither the description of RAPD markers for the species H. commersoni.

Resumo Os princípios e as técnicas aplicadas na extração de DNA desempenham um papel crucial na obtenção de material genético purificado. O presente estudo investiga a eficiência de oito protocolos na extração de DNA de Hypostomus commersoni, um importante componente ictiofaunístico de riachos da América do Sul. A qualidade das amostras foi avaliada por espectrofotometria, eletroforese em gel e amplificação por marcadores de PCR-RAPD. A eficiência da extração de DNA foi influenciada tanto pelo método aplicado quanto pelo tecido-alvo de escolha. Maiores concentrações e rendimento de DNA foram obtidos a partir do tecido ocular, com um espectro positivo de incubação em tampão de lise por até 36 horas após a coleta da amostra, utilizando tecidos frescos e na presença de alta concentração de proteinase K (20 mg.ml-1). Nestas condições, as amostras foram amplificadas com sucesso. Até o momento, não há registro de descrição para os parâmetros analisados neste trabalho, nem a descrição de marcadores RAPD para a espécie H. commersoni.

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RESUMO

The principle and the techniques applied in DNA extraction play a pivotal role in the obtention of a purified genetic material. The present study investigates the efficiency of eight protocols in the DNA extraction of Hypostomus commersoni, an essential component of South American freshwater ichthyofauna. The quality of samples was assessed through spectrophotometry, gel electrophoresis, and PCR-RAPD markers amplification. The efficiency of DNA extraction was influenced both by the method applied and the target-tissue of choice. Higher concentrations and yield of DNA were obtained from ocular tissue, with a positive spectrum of incubation in lysis buffer for up to 36 hours after sample collection, using fresh tissues and in the presence of a high concentration of Proteinase K (20 mg.ml-1). In these conditions, samples were successfully amplified. To date, there is no record of description for the parameters analyzed in this work, neither the description of RAPD markers for the species H. commersoni.(AU)

Os princípios e as técnicas aplicadas na extração de DNA desempenham um papel crucial na obtenção de material genético purificado. O presente estudo investiga a eficiência de oito protocolos na extração de DNA de Hypostomus commersoni, um importante componente ictiofaunístico de riachos da América do Sul. A qualidade das amostras foi avaliada por espectrofotometria, eletroforese em gel e amplificação por marcadores de PCR-RAPD. A eficiência da extração de DNA foi influenciada tanto pelo método aplicado quanto pelo tecido-alvo de escolha. Maiores concentrações e rendimento de DNA foram obtidos a partir do tecido ocular, com um espectro positivo de incubação em tampão de lise por até 36 horas após a coleta da amostra, utilizando tecidos frescos e na presença de alta concentração de proteinase K (20 mg.ml-1). Nestas condições, as amostras foram amplificadas com sucesso. Até o momento, não há registro de descrição para os parâmetros analisados neste trabalho, nem a descrição de marcadores RAPD para a espécie H. commersoni.(AU)

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RESUMO

Molecular detection of Eimeria species in fecal samples can be useful for experimental and diagnostic purposes. However, the parasite quantity presence in feces and the oocyst wall are an obstacle in DNA extraction protocols. Therefore, adequate sampling and effective disruption of the oocysts are essential to improve the accuracy of DNA detection by PCR. The aims of this study were to evaluate the suitability of six protocols for DNA extraction from Eimeria spp. present in bovine and sheep. Twenty pools of fecal samples from cattle (10 pools) and sheep (10 pools) were distributed to six DNA extraction protocols: commercial kit, commercial kit with modification, DNAzol, cetyl-trimethyl ammonium bromide (CTAB), glass beads and commercial kit for fecal samples. Fecal samples were submitted to DNA extraction and PCR. Among the protocols tested, CTAB was determined to be most suitable for DNA extraction from oocysts (90% of DNA detection by PCR); DNAzol and CTAB resulted in higher DNA detection from bovine samples (80%). CTAB and commercial kit with modification improved PCR detection of Eimeria spp. in sheep samples, with positive amplification of DNA in all tested samples.(AU)

A detecção molecular de espécies de Eimeria em amostras fecais pode ser útil para fins experimentais e de diagnóstico. No entanto, a quantidade de parasitas nas fezes e a parede do oocisto são um obstáculo nos protocolos de extração de DNA. Portanto, uma amostragem adequada e a ruptura efetiva dos oocistos são essenciais para melhorar a precisão da detecção de DNA por PCR. Os objetivos deste estudo foram avaliar seis protocolos para extração de DNA de Eimeria spp. em amostras de bovinos e ovinos. Foram distribuídos 20 grupos de amostras fecais de bovinos (10 grupos) e ovinos (10 grupos) em seis protocolos de extração de DNA: kit comercial, kit comercial com modificação, DNAzol, brometo de cetil-trimetil amônio (CTAB), pérolas de vidro e kit comercial para amostras fecais. As amostras fecais foram submetidas à extração de DNA e PCR. Entre os protocolos testados, CTAB foi considerado o mais adequado para extração de DNA de oocistos (90% de detecção de DNA por PCR); DNAzol e CTAB resultaram em maior detecção de DNA em amostras de bovinos (80%). CTAB e kit comercial com modificação melhoraram a detecção por PCR de Eimeria spp. em amostras de ovinos, amplificação positiva de DNA em todas as amostras testadas.(AU)

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Abstract The principle and the techniques applied in DNA extraction play a pivotal role in the obtention of a purified genetic material. The present study investigates the efficiency of eight protocols in the DNA extraction of Hypostomus commersoni, an essential component of South American freshwater ichthyofauna. The quality of samples was assessed through spectrophotometry, gel electrophoresis, and PCR-RAPD markers amplification. The efficiency of DNA extraction was influenced both by the method applied and the target-tissue of choice. Higher concentrations and yield of DNA were obtained from ocular tissue, with a positive spectrum of incubation in lysis buffer for up to 36 hours after sample collection, using fresh tissues and in the presence of a high concentration of Proteinase K (20 mg.ml-1). In these conditions, samples were successfully amplified. To date, there is no record of description for the parameters analyzed in this work, neither the description of RAPD markers for the species H. commersoni.

Resumo Os princípios e as técnicas aplicadas na extração de DNA desempenham um papel crucial na obtenção de material genético purificado. O presente estudo investiga a eficiência de oito protocolos na extração de DNA de Hypostomus commersoni, um importante componente ictiofaunístico de riachos da América do Sul. A qualidade das amostras foi avaliada por espectrofotometria, eletroforese em gel e amplificação por marcadores de PCR-RAPD. A eficiência da extração de DNA foi influenciada tanto pelo método aplicado quanto pelo tecido-alvo de escolha. Maiores concentrações e rendimento de DNA foram obtidos a partir do tecido ocular, com um espectro positivo de incubação em tampão de lise por até 36 horas após a coleta da amostra, utilizando tecidos frescos e na presença de alta concentração de proteinase K (20 mg.ml-1). Nestas condições, as amostras foram amplificadas com sucesso. Até o momento, não há registro de descrição para os parâmetros analisados neste trabalho, nem a descrição de marcadores RAPD para a espécie H. commersoni.

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ABSTRACT: Molecular detection of Eimeria species in fecal samples can be useful for experimental and diagnostic purposes. However, the parasite quantity presence in feces and the oocyst wall are an obstacle in DNA extraction protocols. Therefore, adequate sampling and effective disruption of the oocysts are essential to improve the accuracy of DNA detection by PCR. The aims of this study were to evaluate the suitability of six protocols for DNA extraction from Eimeria spp. present in bovine and sheep. Twenty pools of fecal samples from cattle (10 pools) and sheep (10 pools) were distributed to six DNA extraction protocols: commercial kit, commercial kit with modification, DNAzol, cetyl-trimethyl ammonium bromide (CTAB), glass beads and commercial kit for fecal samples. Fecal samples were submitted to DNA extraction and PCR. Among the protocols tested, CTAB was determined to be most suitable for DNA extraction from oocysts (90% of DNA detection by PCR); DNAzol and CTAB resulted in higher DNA detection from bovine samples (80%). CTAB and commercial kit with modification improved PCR detection of Eimeria spp. in sheep samples, with positive amplification of DNA in all tested samples.

RESUMO: A detecção molecular de espécies de Eimeria em amostras fecais pode ser útil para fins experimentais e de diagnóstico. No entanto, a quantidade de parasitas nas fezes e a parede do oocisto são um obstáculo nos protocolos de extração de DNA. Portanto, uma amostragem adequada e a ruptura efetiva dos oocistos são essenciais para melhorar a precisão da detecção de DNA por PCR. Os objetivos deste estudo foram avaliar seis protocolos para extração de DNA de Eimeria spp. em amostras de bovinos e ovinos. Foram distribuídos 20 grupos de amostras fecais de bovinos (10 grupos) e ovinos (10 grupos) em seis protocolos de extração de DNA: kit comercial, kit comercial com modificação, DNAzol, brometo de cetil-trimetil amônio (CTAB), pérolas de vidro e kit comercial para amostras fecais. As amostras fecais foram submetidas à extração de DNA e PCR. Entre os protocolos testados, CTAB foi considerado o mais adequado para extração de DNA de oocistos (90% de detecção de DNA por PCR); DNAzol e CTAB resultaram em maior detecção de DNA em amostras de bovinos (80%). CTAB e kit comercial com modificação melhoraram a detecção por PCR de Eimeria spp. em amostras de ovinos, amplificação positiva de DNA em todas as amostras testadas.

RESUMO

In this study, a non-destructive, high-throughput, endosperm-based DNA extraction method was developed. To verify the non-destructive nature of this method, a germination test was performed on 288 seeds after sampling their endosperm, which gave a seedling emergence rate that was higher (97.6%) than that of the control group (92%). To confirm the feasibility of the new method, DNA was extracted from plants of a BC1F2 population by two different methods, namely, from endosperm using our rapid, high-throughput method (ER-DNA) and from young leaves emerging from the same sampled seed using the CTAB method (LC-DNA). The ER-DNA was undetectable by agarose gel electrophoresis, but was found to be an adequate replacement for LC-DNA for the amplification and detection of simple sequence repeats (SSRs). Further analysis revealed that ER-DNA was generally suitable for the generation of specific 500-750-bp fragments, but not for the amplification of 1,000-2,000-bp fragments. Our rapid, high-throughput method therefore has no deleterious effects on wheat seeds and yields DNA for SSR genotyping that is a suitable alternative to traditionally obtained DNA.(AU)

Neste estudo, foi desenvolvido um método de extração de DNA não destrutivo, de alto débito e endosperma. Para verificar a natureza não destrutiva deste método, um teste de germinação foi realizado em 288 sementes após a amostragem do endosperma, o que deu uma taxa de emergência de plântulas maior (97,6%) do que a do grupo controle (92%). Para confirmar a viabilidade do novo método, o DNA foi extraído de plantas de uma população de BC1F2 por dois métodos diferentes, a saber, do endosperma usando nosso método rápido de alto rendimento (ER-DNA) e de folhas jovens que emergem da mesma semente amostrada usando o método CTAB (LC-DNA). O ER-DNA foi indetectável por eletroforese em gel de agarose, mas foi encontrado como uma substituição adequada para LC-DNA para a amplificação e detecção de repetições simples de seqüência (SSRs). Uma análise posterior revelou que o ER-DNA era geralmente adequado para a geração de fragmentos específicos de 500-750 pb, mas não para a amplificação de fragmentos de 1.000-2.000 pb. Nosso método rápido e de alto débito, portanto, não tem efeitos deletérios sobre as sementes de trigo e produz DNA para a genotipagem de SSR que é uma alternativa adequada ao DNA obtido tradicionalmente.(AU)

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ABSTRACT: In this study, a non-destructive, high-throughput, endosperm-based DNA extraction method was developed. To verify the non-destructive nature of this method, a germination test was performed on 288 seeds after sampling their endosperm, which gave a seedling emergence rate that was higher (97.6%) than that of the control group (92%). To confirm the feasibility of the new method, DNA was extracted from plants of a BC1F2 population by two different methods, namely, from endosperm using our rapid, high-throughput method (ER-DNA) and from young leaves emerging from the same sampled seed using the CTAB method (LC-DNA). The ER-DNA was undetectable by agarose gel electrophoresis, but was found to be an adequate replacement for LC-DNA for the amplification and detection of simple sequence repeats (SSRs). Further analysis revealed that ER-DNA was generally suitable for the generation of specific 500-750-bp fragments, but not for the amplification of 1,000-2,000-bp fragments. Our rapid, high-throughput method therefore has no deleterious effects on wheat seeds and yields DNA for SSR genotyping that is a suitable alternative to traditionally obtained DNA.

RESUMO: Neste estudo, foi desenvolvido um método de extração de DNA não destrutivo, de alto débito e endosperma. Para verificar a natureza não destrutiva deste método, um teste de germinação foi realizado em 288 sementes após a amostragem do endosperma, o que deu uma taxa de emergência de plântulas maior (97,6%) do que a do grupo controle (92%). Para confirmar a viabilidade do novo método, o DNA foi extraído de plantas de uma população de BC1F2 por dois métodos diferentes, a saber, do endosperma usando nosso método rápido de alto rendimento (ER-DNA) e de folhas jovens que emergem da mesma semente amostrada usando o método CTAB (LC-DNA). O ER-DNA foi indetectável por eletroforese em gel de agarose, mas foi encontrado como uma substituição adequada para LC-DNA para a amplificação e detecção de repetições simples de seqüência (SSRs). Uma análise posterior revelou que o ER-DNA era geralmente adequado para a geração de fragmentos específicos de 500-750 pb, mas não para a amplificação de fragmentos de 1.000-2.000 pb. Nosso método rápido e de alto débito, portanto, não tem efeitos deletérios sobre as sementes de trigo e produz DNA para a genotipagem de SSR que é uma alternativa adequada ao DNA obtido tradicionalmente.

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Abstract The principle and the techniques applied in DNA extraction play a pivotal role in the obtention of a purified genetic material. The present study investigates the efficiency of eight protocols in the DNA extraction of Hypostomus commersoni, an essential component of South American freshwater ichthyofauna. The quality of samples was assessed through spectrophotometry, gel electrophoresis, and PCR-RAPD markers amplification. The efficiency of DNA extraction was influenced both by the method applied and the target-tissue of choice. Higher concentrations and yield of DNA were obtained from ocular tissue, with a positive spectrum of incubation in lysis buffer for up to 36 hours after sample collection, using fresh tissues and in the presence of a high concentration of Proteinase K (20 mg.ml-1). In these conditions, samples were successfully amplified. To date, there is no record of description for the parameters analyzed in this work, neither the description of RAPD markers for the species H. commersoni.

Resumo Os princípios e as técnicas aplicadas na extração de DNA desempenham um papel crucial na obtenção de material genético purificado. O presente estudo investiga a eficiência de oito protocolos na extração de DNA de Hypostomus commersoni, um importante componente ictiofaunístico de riachos da América do Sul. A qualidade das amostras foi avaliada por espectrofotometria, eletroforese em gel e amplificação por marcadores de PCR-RAPD. A eficiência da extração de DNA foi influenciada tanto pelo método aplicado quanto pelo tecido-alvo de escolha. Maiores concentrações e rendimento de DNA foram obtidos a partir do tecido ocular, com um espectro positivo de incubação em tampão de lise por até 36 horas após a coleta da amostra, utilizando tecidos frescos e na presença de alta concentração de proteinase K (20 mg.ml-1). Nestas condições, as amostras foram amplificadas com sucesso. Até o momento, não há registro de descrição para os parâmetros analisados neste trabalho, nem a descrição de marcadores RAPD para a espécie H. commersoni.

RESUMO

ABSTRACT: Bovine tuberculosis is an infectious disease with a high impact on the cattle industry, particularly in developing countries. PCR is a very sensitive method for detection of infectious agents, but the sensitivity of molecular diagnosis is largely dependent on the efficiency of the DNA extraction methods. The objective of this study was to evaluate DNA extraction methods for direct detection of Mycobacterium bovis in bovine tissue. Nine commercial kits for DNA extraction were evaluated when combined with two real time PCRs. The DNeasy Blood & Tissue Kit from QIAGEN showed better performance and sensitivity followed by the DNA Mini Kit RBC and FTA Elute Micro Card. Results suggested that, even when the analytical sensitivity of the qPCR is very high, the extraction method can influence the diagnostic sensitivity.

RESUMO: A tuberculose bovina é uma doença infecciosa com um alto impacto na pecuária, particularmente em países em desenvolvimento. A PCR é um método muito sensível para a detecção de agentes infecciosos, mas a sensibilidade do diagnóstico molecular é em grande parte dependente da eficiência dos métodos de extração de DNA. O objetivo deste estudo foi avaliar métodos de extração de DNA para detecção direta de Mycobacterium bovisem tecido bovino. Nove kits comerciais para extração de DNA foram avaliados, quando combinados com duas PCRs em tempo real. O Kit Dneasy Blood & Tissue da Qiagen apresentou melhor desempenho e sensibilidade, seguido dos kits DNA Mini RBC e FTA Elute Micro Card (protocolo modificado com digestão enzimática prévia). Os resultados sugerem que, mesmo quando a sensibilidade analítica do qPCR é muito elevada, o método de extração pode influenciar na sensibilidade de diagnóstico.

RESUMO

Bovine tuberculosis is an infectious disease with a high impact on the cattle industry, particularly in developing countries. PCR is a very sensitive method for detection of infectious agents, but the sensitivity of molecular diagnosis is largely dependent on the efficiency of the DNA extraction methods. The objective of this study was to evaluate DNA extraction methods for direct detection of Mycobacterium bovis in bovine tissue. Nine commercial kits for DNA extraction were evaluated when combined with two real time PCRs. The DNeasy Blood & Tissue Kit from QIAGEN showed better performance and sensitivity followed by the DNA Mini Kit RBC and FTA Elute Micro Card. Results suggested that, even when the analytical sensitivity of the qPCR is very high, the extraction method can influence the diagnostic sensitivity.(AU)

A tuberculose bovina é uma doença infecciosa com um alto impacto na pecuária, particularmente em países em desenvolvimento. A PCR é um método muito sensível para a detecção de agentes infecciosos, mas a sensibilidade do diagnóstico molecular é em grande parte dependente da eficiência dos métodos de extração de DNA. O objetivo deste estudo foi avaliar métodos de extração de DNA para detecção direta de Mycobacterium bovis em tecido bovino. Nove kits comerciais para extração de DNA foram avaliados, quando combinados com duas PCRs em tempo real. O Kit Dneasy Blood & Tissue da Qiagen apresentou melhor desempenho e sensibilidade, seguido dos kits DNA Mini RBC e FTA Elute Micro Card (protocolo modificado com digestão enzimática prévia). Os resultados sugerem que, mesmo quando a sensibilidade analítica do qPCR é muito elevada, o método de extração pode influenciar na sensibilidade de diagnóstico.(AU)

Assuntos

RESUMO

The current scenario of international beef trading has increased the pressure for better and faster diagnosis of bovine tuberculosis. Although traditional culture remains the gold standard method to confirm Mycobacterium bovis infection, it is exceedingly time consuming, and demands viable mycobacteria. Molecular methods overcome the flaws of the bacteriological methods with faster detection and identification. However, mycobacterial features like a complex cell wall and pathogenhost interaction make the molecular detection a challenge. Three protocols for DNA extraction (A, B and C) from bovine tissues were tested to verify the most suitable technique for routine diagnostic assessment of their specificity and sensitivity. Thirty culture-positive and thirty culture-negative granulomatous lesions were included in the trial. From each sample, three tissue suspensions at different dilutions (10-1, 10-2 and 10-3) were prepared and submitted to DNA extraction. PCR procedures targeting IS6110 were performed, employing two volumes of DNA: 5 µL of all three dilutions, and 2.5 µL of the 10-1 dilution. Protocol A was able to detect members of the M. tuberculosis complex in most samples. The sensitivity of the test decreased with increase in tissue-suspension dilution. Although Protocol A presented the highest sensitivity followed by C and B, it showed the lowest specificity, which can be due to a failure in primary isolation caused by the lack of viable organisms or incubation time. Regardless classical bacteriological methods are still recommended by OIE, after evaluating the sensitivity of DNA extraction protocols and PCR procedures, we conclude that the best strategy for M. bovis detection is to follow Protocol A on concentrated tissue suspensions.(AU)

O atual comércio internacional de carne tem aumentado a pressão para haver um melhor e mais rápido diagnóstico de tuberculose bovina. O tradicional cultivo continua a ser o método padrão ouro para confirmar a infecção por Mycobacterium bovis, apesar de ser excessivamente demorado e necessitar de micobactérias viáveis. Métodos moleculares representam a superação de todos os defeitos dos métodos bacteriológicos com detecção e identificação mais rápidas. Entretanto, características das micobactérias, como uma complexa parede celular e a interação patógeno-hospedeiro, torna-os um desafio. Três protocolos de extração de DNA (A, B e C) foram testados em tecidos bovinos para verificar qual técnica é mais adequada para diagnóstico de rotina, avaliando sua especificidade e sensibilidade. Trinta lesões granulomatosas positivas no cultivo e 30 lesões granulomatosas negativas no cultivo foram utilizadas no experimento. A partir de cada amostra, três homogeneizados com diferentes diluições (10-1, 10-2 e 10-3) foram preparadas e submetidas à extração de DNA. A PCR para o gene alvo IS6110 foi realizada empregando-se dois volumes de DNA: um com 5 µL para todas as três diluições e outro com 2,5 µL da diluição 10-1. O Protocolo A foi capaz de detectar membros do complexo M. tuberculosis na maior parte das amostras. À medida que a diluição dos homogeneizados aumentou, a sensibilidade diminuiu. Embora o Protocolo A tenha apresentado a maior sensibilidade, seguido por C e B, este revelou a menor especificidade, que pode ser devido à insuficiência de organismos viáveis ou tempo de incubação no primo isolamento. Apesar de os métodos bacteriológicos clássicos ainda serem recomendados pela OIE, através da avaliação da sensibilidade dos protocolos de extração de DNA e dos procedimentos de PCR, concluímos que a melhor estratégia para a detecção de M. bovis é usar o Protocolo A em homogeneizados mais concentrados.(AU)

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The current scenario of international beef trading has increased the pressure for better and faster diagnosis of bovine tuberculosis. Although traditional culture remains the gold standard method to confirm Mycobacterium bovis infection, it is exceedingly time consuming, and demands viable mycobacteria. Molecular methods overcome the flaws of the bacteriological methods with faster detection and identification. However, mycobacterial features like a complex cell wall and pathogenhost interaction make the molecular detection a challenge. Three protocols for DNA extraction (A, B and C) from bovine tissues were tested to verify the most suitable technique for routine diagnostic assessment of their specificity and sensitivity. Thirty culture-positive and thirty culture-negative granulomatous lesions were included in the trial. From each sample, three tissue suspensions at different dilutions (10-1, 10-2 and 10-3) were prepared and submitted to DNA extraction. PCR procedures targeting IS6110 were performed, employing two volumes of DNA: 5 µL of all three dilutions, and 2.5 µL of the 10-1 dilution. Protocol A was able to detect members of the M. tuberculosis complex in most samples. The sensitivity of the test decreased with increase in tissue-suspension dilution. Although Protocol A presented the highest sensitivity followed by C and B, it showed the lowest specificity, which can be due to a failure in primary isolation caused by the lack of viable organisms or incubation time. Regardless classical bacteriological methods are still recommended by OIE, after evaluating the sensitivity of DNA extraction protocols and PCR procedures, we conclude that the best strategy for M. bovis detection is to follow Protocol A on concentrated tissue suspensions.

O atual comércio internacional de carne tem aumentado a pressão para haver um melhor e mais rápido diagnóstico de tuberculose bovina. O tradicional cultivo continua a ser o método padrão ouro para confirmar a infecção por Mycobacterium bovis, apesar de ser excessivamente demorado e necessitar de micobactérias viáveis. Métodos moleculares representam a superação de todos os defeitos dos métodos bacteriológicos com detecção e identificação mais rápidas. Entretanto, características das micobactérias, como uma complexa parede celular e a interação patógeno-hospedeiro, torna-os um desafio. Três protocolos de extração de DNA (A, B e C) foram testados em tecidos bovinos para verificar qual técnica é mais adequada para diagnóstico de rotina, avaliando sua especificidade e sensibilidade. Trinta lesões granulomatosas positivas no cultivo e 30 lesões granulomatosas negativas no cultivo foram utilizadas no experimento. A partir de cada amostra, três homogeneizados com diferentes diluições (10-1, 10-2 e 10-3) foram preparadas e submetidas à extração de DNA. A PCR para o gene alvo IS6110 foi realizada empregando-se dois volumes de DNA: um com 5 µL para todas as três diluições e outro com 2,5 µL da diluição 10-1. O Protocolo A foi capaz de detectar membros do complexo M. tuberculosis na maior parte das amostras. À medida que a diluição dos homogeneizados aumentou, a sensibilidade diminuiu. Embora o Protocolo A tenha apresentado a maior sensibilidade, seguido por C e B, este revelou a menor especificidade, que pode ser devido à insuficiência de organismos viáveis ou tempo de incubação no primo isolamento. Apesar de os métodos bacteriológicos clássicos ainda serem recomendados pela OIE, através da avaliação da sensibilidade dos protocolos de extração de DNA e dos procedimentos de PCR, concluímos que a melhor estratégia para a detecção de M. bovis é usar o Protocolo A em homogeneizados mais concentrados.

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With advances of farming and research in the area of molecular genetics, studies that can help with obtaining good quality DNA are necessary. The objective was to evaluate the efficiency of DNA extraction in different types of tissues of three species of carp by using the protocol of DNA extraction with Sodium Chloride (NaCl). The samples were subjected to DNA extraction, and the integrity was visualized on 1.5% agarose gel. In a total of 72 samples used for DNA extraction, all of them were positive, confirmed by the presence of bands on agarose gel. The capacity of amplifying the extracted DNA was tested by amplification reactions using the RAPD (random amplification of polymorphic DNA) technique, confirming that the DNA was of good quality for use in subsequent studies with molecular markers.(AU)

Com o avanço da piscicultura e das pesquisas na área da genética molecular, existe a necessidade de estudos que possam aperfeiçoar a obtenção de DNA com boa qualidade. Diante disso, o objetivo desse trabalho foi avaliar a eficiência da extração de DNA em diferentes tipos de tecidos de três espécies de carpas, através do protocolo de extração de DNA com cloreto de sódio (NaCl). As amostras foram submetidas à extração de DNA e a integridade foi visualizada em gel de agarose 1,5%. Em um total de 72 amostras utilizadas na extração de DNA, todas foram positivas, confirmadas com a presença de banda no gel de agarose. A capacidade de amplificação do DNA extraído foi testada através de reações de amplificação utilizando a técnica RAPD (polimorfismos de DNA amplificados ao acaso), confirmando que o DNA apresenta boas condições para utilização em estudos posteriores com marcadores moleculares.(AU)

Assuntos

RESUMO

With advances of farming and research in the area of molecular genetics, studies that can help with obtaining good quality DNA are necessary. The objective was to evaluate the efficiency of DNA extraction in different types of tissues of three species of carp by using the protocol of DNA extraction with Sodium Chloride (NaCl). The samples were subjected to DNA extraction, and the integrity was visualized on 1.5% agarose gel. In a total of 72 samples used for DNA extraction, all of them were positive, confirmed by the presence of bands on agarose gel. The capacity of amplifying the extracted DNA was tested by amplification reactions using the RAPD (random amplification of polymorphic DNA) technique, confirming that the DNA was of good quality for use in subsequent studies with molecular markers.

Com o avanço da piscicultura e das pesquisas na área da genética molecular, existe a necessidade de estudos que possam aperfeiçoar a obtenção de DNA com boa qualidade. Diante disso, o objetivo desse trabalho foi avaliar a eficiência da extração de DNA em diferentes tipos de tecidos de três espécies de carpas, através do protocolo de extração de DNA com cloreto de sódio (NaCl). As amostras foram submetidas à extração de DNA e a integridade foi visualizada em gel de agarose 1,5%. Em um total de 72 amostras utilizadas na extração de DNA, todas foram positivas, confirmadas com a presença de banda no gel de agarose. A capacidade de amplificação do DNA extraído foi testada através de reações de amplificação utilizando a técnica RAPD (polimorfismos de DNA amplificados ao acaso), confirmando que o DNA apresenta boas condições para utilização em estudos posteriores com marcadores moleculares.

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Foram testados três métodos de extração de DNA em amostras de queijo, com o objetivo de identificar uma técnica eficiente para extração de DNA em amostras com várias limitações, como alto teor de gordura, alto grau de degradação do DNA e grande concentração de impurezas. A técnica que faz uso do tiocianato de guanidina mostrou-se mais adequada para identificação de adição intencional não declarada de leite bovino em queijos bubalinos, podendo ser empregada para certificação de produto específico (selo de Identidade de Espécie).

Three methods of DNA extraction were tested in cheese samples. The objective of this study was to identify an efficient technique for DNA extraction in different samples with several limitations, such as high fat tenor, high degree of DNA degradation and great sludge concentration. The technique using Guanidine thiocyanate was more appropriate for identification of intentional undeclared addition of bovine milk in buffalo cheeses. This technique can be used for certification of a specific product (stamp of Identity of Species).

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Foram testados três métodos de extração de DNA em amostras de queijo, com o objetivo de identificar uma técnica eficiente para extração de DNA em amostras com várias limitações, como alto teor de gordura, alto grau de degradação do DNA e grande concentração de impurezas. A técnica que faz uso do tiocianato de guanidina mostrou-se mais adequada para identificação de adição intencional não declarada de leite bovino em queijos bubalinos, podendo ser empregada para certificação de produto específico (selo de Identidade de Espécie).(AU)

Three methods of DNA extraction were tested in cheese samples. The objective of this study was to identify an efficient technique for DNA extraction in different samples with several limitations, such as high fat tenor, high degree of DNA degradation and great sludge concentration. The technique using Guanidine thiocyanate was more appropriate for identification of intentional undeclared addition of bovine milk in buffalo cheeses. This technique can be used for certification of a specific product (stamp of Identity of Species).(AU)

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RESUMO

A identificação do sexo tem sido estudada principalmente para fins de manejo ou comerciais. O presente estudo visou determinar a menor quantidade de DNA extraída com CTAB a 10%, necessária para identificar o sexo genético das espécies caprina e ovina, sendo usados diferentes protocolos de reações em cadeia da polimerase (PCR) multiplex para os genes SRY, Aml-X e regiões ZFX/ZFY. O DNA foi extraído do sangue de 20 animais de cada espécie. A PCR foi realizada utilizando-se SRY na identificação do cromossomo Y e tanto Aml-X quanto ZFX/ZFY como controles. As amostras com quantidades acima de 1,0 ng apresentaram 100% de amplificações nos protocolos empregados, o que sugere a viabilidade das técnicas utilizadas para identificação sexual, que futuramente poderão ser utilizadas em biópsias embrionárias ou em espermatozoides.

The identification of the sex has been studied mostly for handling and commercial finalities. This study aimed to determine the smallest amount of DNA possible (extracted with 10% CTAB) to identify the genetic sex of goat and sheep using different multiplex polymerase chain reaction (PCR) protocols for genes SRY and Aml-X and regions ZFX/ZFY. The DNA was extracted from the blood of 20 animals of both species. The PCR was carried out for each species using SRY to identify chromosome Y, while both Aml-X and ZFX/ZFY were used as control. The samples with quantities higher than 1.0 ng showed 100% amplifications in the protocols used, which suggests the viability of the these techniques for sexing, and they can be used in the future in embryo biopsies and sperma.

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RESUMO

A identificação do sexo tem sido estudada principalmente para fins de manejo ou comerciais. O presente estudo visou determinar a menor quantidade de DNA extraída com CTAB a 10%, necessária para identificar o sexo genético das espécies caprina e ovina, sendo usados diferentes protocolos de reações em cadeia da polimerase (PCR) multiplex para os genes SRY, Aml-X e regiões ZFX/ZFY. O DNA foi extraído do sangue de 20 animais de cada espécie. A PCR foi realizada utilizando-se SRY na identificação do cromossomo Y e tanto Aml-X quanto ZFX/ZFY como controles. As amostras com quantidades acima de 1,0 ng apresentaram 100% de amplificações nos protocolos empregados, o que sugere a viabilidade das técnicas utilizadas para identificação sexual, que futuramente poderão ser utilizadas em biópsias embrionárias ou em espermatozoides.(AU)

The identification of the sex has been studied mostly for handling and commercial finalities. This study aimed to determine the smallest amount of DNA possible (extracted with 10% CTAB) to identify the genetic sex of goat and sheep using different multiplex polymerase chain reaction (PCR) protocols for genes SRY and Aml-X and regions ZFX/ZFY. The DNA was extracted from the blood of 20 animals of both species. The PCR was carried out for each species using SRY to identify chromosome Y, while both Aml-X and ZFX/ZFY were used as control. The samples with quantities higher than 1.0 ng showed 100% amplifications in the protocols used, which suggests the viability of the these techniques for sexing, and they can be used in the future in embryo biopsies and sperma.(AU)

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La identificación de Salmonella spp. por diagnóstico microbiológico en muestras de alimentos es tardada, y consta de aproximadamente cinco etapas diferentes, lo que lleva cerca de 120 horas hasta el resultado final. La utilización de la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) puede disminuir dicho periodo. No obstante, sustancias presentes en las muestras pueden afectar el resultado de la prueba. El objetivo de este trabajo fue comparar la extracción de ADN por tratamiento térmico y por el uso de bromuro de cetiltrimetil amonio (CTAB) en PCR para la detección de Salmonellla enterica serotipo Enteritidis (SE) en productos utilizados como materia prima provenientes de granjas avícolas (harina de carne) y frotes de arrastre contaminados experimentalmente. Los materiales obtenidos con las extracciones fueron sometidos a PCR, utilizando un par de oligonucleótidos iniciadores para la amplificación del ADN de lo gene Sdf 1. Basados en la comparación de los métodos de extracción, se observó que usando el CTBA se detectó SE en 70% de la materia prima y 80% en frotes de arrastre, mientras que con el método de tratamiento térmico hubo una positividad de la bacteria de 20% en materia prima y 40% en frotes de arrastre. Hubo detección de SE en los dos métodos para extracción de ADN, sin embargo, en comparación con el tratamiento térmico, el uso de CTBA detectó como positivas una

The identification of Salmonella spp. in food samples by microbiological diagnosis is time consuming, with approximately five different stages, requiring about 120 hours until the final result. The utilization of the polymerase chain reaction technique (PCR) can reduce this time, but substances present in samples may affect the reaction. The present work aimed to compare DNA extraction by thermic treatment and by the use of cetyltrimethil ammonium bromide (CTAB), in products originated from poultry houses corresponding to raw material (meat meal) and experimentally contaminated drag swabs. Materials obtained from the extractions were submitted to PCR, utilizing a pair of initiator oligonucleotides for amplification of Sdf 1 gene fragments. Comparing the methods of extraction, it was observed that when CTAB was employed, SE was detected in 70% of meat meal and in 80% of drag swabs, while the thermic treatment method yielded positive results in 20% of meat meal and in 40% of drag swabs. SE was detected under both methods utilized for DNA extraction, but the use of CTAB detected a greater number of positive samples, compared with thermal treatment.KEYWORDS: PCR, Salmonella Enteritidis, chicken, DNA extraction, CTAB.

A identificação de Salmonella spp. em amostras de alimentos por diagnóstico microbiológico é demorada, com aproximadamente cinco diferentes etapas, levando cerca de 120 horas até o resultado final. A utilização da técnica da reação em cadeia da polimerase (PCR) pode diminuir esse período; entretanto, substâncias presentes nas amostras podem afetar a reação. O objetivo deste trabalho foi comparar a extração de DNA de Salmonella enterica sorovar Enteritidis (SE), por tratamento térmico e pelo uso do cetyltrimethil ammonium bromide (CTAB), em produtos provenientes de granjas avícolas, correspondentes a matéria prima (farinha de carne) e a suabes de arrasto experimentalmente contaminados. As amostras de DNA obtidas com as extrações foram submetidas a PCR, utilizando-se um par de oligonucleotídeos iniciadores para amplificação de DNA do gene específico de SE Sdf 1. Comparando-se os métodos de extração, observou-se que quando do uso do CTAB detectou-se SE em 70% de matéria prima e em 80% de suabes de arrasto, enquanto com o método por tratamento térmico houve positividade em 20% de matéria prima e em 40% de suabes de arrasto. Houve detecção de SE em ambos os métodos utilizados para extração de DNA, porém, o uso de CTAB detectou maior número de amostras positivas, quando comparado com o tratamento térmico.PALAVRAS-CHAVES: PCR, Salmonella Enteritidis, ave, extração de DNA, CTAB.