RESUMO

La adhesión entre las resinas hidrófilas y la dentina se encuentra sometida a una degradación permanente cuya intensidad aumenta en función del tiempo transcurrido. Esto es producto de la actividad de las metaloproteinasas, de las catepsinas y otras enzimas colagenolíticas, responsables de la destrucción paulatina de las fibras colágenas de la capa híbrida. La mayoría de las estrategias para inhibir estas enzimas han sido ensayos de laboratorio, mientras que las investigaciones clínicas son escasas. En este trabajo se analiza la literatura relacionada con las estrategias sugeridas para prevenir la degradación del colágeno de la capa híbrida en la interfaz resina-dentina (AU)

The bonds between hidrophylic resins and dentin are subjected to a time-dependent collagenolytic degradation. Endogenous enzymes such as matrix metalloproteinases, catepsins and other enzymes are responsible for the hybrid layer destruction. The majority of strategies developed to inhibit these enzymes are laboratory evaluations while clinical studies are scarce. This review examines the literature related to the strategies suggested to prevent collagen degradation of the hybrid layer in resin-dentin interfaces (AU)

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The snake venom metalloproteinases (SVMPs) are abundant enzymes in the venoms of viper snakes and responsible for most of the symptoms of envenoming. Their actions are related to the hydrolysis of extracellular matrix components, plasma proteins and hydrolysis or binding to cell surface proteins resulting in the activation or inhibition of their activity. In this work, the main objective was to analyze the implications of the structural and functional diversity of B. neuwiedi venom SVMPs, evaluating their effects on mammal’s hemostatic disorders and against prey or predator of snakes. Initially, we elucidated the partial amino acid sequence of class P-I SVMPs (which presented only 78% similarity to each other), in addition to obtaining the crystal of one. Subsequently we identified different degrees of hemorrhage induced by class P-III SVMPs (with hemorrhagic minimum doses of: 3.08 μg for Ic, 5.67 μg for IIb and 7.55 μg for IIc). In addition, different actions of the SVMPs tested (both P-I and P-III) were observed against extracellular matrix components (adhesion and cleavage) and against endothelial cells (adhesion and viability). It was also observed in the coagulation experiment, the presence of SVMPs that specifically acted on mammalian blood, as well as others that acted only on bird blood, demonstrating a selective action of SVMPs. With this we conclude that there must be the contribution of other factors, besides the structural domains, to the functional diversity of SVMPs. Therefore, the functional diversity of SVMPs contributed to the adaptive role of snake venoms. Key words: Bothrops, metalloproteinases, hemostasis, proteolytic e

As metaloproteinases de venenos de serpentes (SVMPs) são enzimas abundantes em venenos de espécies da família Viperidae e responsáveis por grande parte dos sintomas do envenenamento. Sua ação está relacionada com a proteólise dos componentes da matriz extracelular, proteínas plasmáticas e também com hidrólise ou ligação a proteínas de superfície celular induzindo a ativação ou inibição da atividade das mesmas. Neste trabalho, o principal objetivo foi analisar as implicações da diversidade estrutural e funcional das SVMPs do veneno de B. neuwiedi, avaliando seus efeitos em distúrbios hemostáticos de mamíferos e frente a presa ou predador de serpentes. Inicialmente, elucidamos a sequência parcial de aminoácidos das SVMPs de classe P-I (que apresentaram apenas 78% de similaridade entre si), além de obter o cristal de uma. Posteriormente identificamos diferentes graus de hemorragia induzidos pelas SVMPs de classe P-III (com doses mínimas hemorrágicas de: 3,08 μg para Ic; 5,67 μg para IIb e 7,55 μg para IIc). Além disso, foram observadas diferentes ações das SVMPs testadas (tanto P-I quanto PIII) frente aos componentes de matriz extracelular (adesão e clivagem) e frente às células endoteliais (adesão e viabilidade). Observou-se também, no experimento de coagulação, a presença de SVMPs que atuaram especificamente no sangue de mamífero, assim como outras que atuaram apenas em sangue de ave, demonstrando uma ação seletiva das SVMPs. Deste modo, concluímos que deve haver a contribuição de outros fatores, além dos domínios estruturais, para a diversidade funcional de SVMPs. Não obstante, a diversidade funcional das SVMPs contribuiu para o papel adaptativo dos venenos ofídicos.

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Jellyfishes are amongst the most familiar of venomous marine animals. Jellyfish encounters with humans are common, although subsequent envenomation has varying toxicity ranging from usually mild symptoms to sometimes lethal consequences. Jellyfish venoms are of biotechnological importance, with toxins displaying antimicrobial, analgesic and anti-tumor activities. Furthermore, proteolytic enzymes have also been described. Recently, the proteomic profile of putative toxins isolated from nematocysts of the hydromedusae Olindias sambaquiensis was reported, which included protease and phospholipase enzymes. Here we present the results of a study to experimentally confirm enzymatic activity in extract of O. sambaquiensis tentacles. Specimens of O. sambaquiensis were collected at the coast of São Sebastião, SP, Brazil. A procedure to generate tentacle extract was standardised, yielding high quantities of proteins of different molecular masses. The extract was assayed for the presence of metalloproteases, serine proteases and phospholipase A2 activities using substrates that cover a wide range of each class of these enzymes and also specific substrates for metalloproteases ADAMs and MMPs. The extract showed activity towards all substrates confirming previous proteomic evidence for the presence of these enzymes. In addition, proteolytic activity was also detected by zymography assays on casein and gelatin. However, when comparing these activities to snake venoms, which are rich in proteases and phospholipases, the metalloprotease activity detected was lower than the high levels observed in Bothrops jararaca venom, but levels of serine protease and phospholipase A2 enzyme activity was comparable to the one observed in venoms of Bothrops snakes, known for its strong anti-coagulant and myotoxic activities due to serine proteases and phospholipases A2 molecules, respectively. These data validate the functional properties of proteins characterised previously by proteomics and provide a better understanding of the toxin arsenal of this underexplored venomous animal, indicating the role of active serine proteases and phospholipases A2 in the action of the venom.

As águas-vivas ou medusas estão entre os animais peçonhentos marinhos mais populares. Acidentes envolvendo medusas são comuns e sua toxicidade para humanos pode variar de sintomas leves até envenenamentos fatais em alguns casos. Os venenos de medusas são de importância biotecnológica, apresentando toxinas com atividade antimicrobiana, analgésica e antitumoral. Além disso, enzimas proteolíticas também já foram descritas. Recentemente o perfil proteômico de toxinas putativas dos nematocistos isolados da hidromedusa Olindias sambaquiensis foi caracterizado, identificando a presença de proteases e fosfolipases. Nesse trabalho nós apresentamos os resultados de um estudo que confirma a presença de atividade enzimática no extrato de tentáculos de O. sambaquiensis. Os espécimes foram coletados na costa de São Sebastião, SP, Brasil. O procedimento para obtenção do extrato de tentáculos foi padronizado, rendendo grande quantidade de proteínas de diferentes massas moleculares. O extrato foi avaliado quanto a presença de atividade de metaloproteases, serino proteases e fosfolipases A2, utilizando substratos genéricos para essas enzimas e também substratos específicos para as metaloproteases do tipo ADAMs e MMPs. O extrato apresentou atividade sobre todos os substratos, confirmando evidências proteômicas anteriores. Além disso, a atividade proteolítica também foi detectada por ensaios de zimografia em caseína e gelatina. Quando comparamos essas atividades com venenos de serpentes, que são abundantes em proteases e fosfolipases, a atividade de metaloproteases obtida foi bem menor que os altos índices demonstrados pelo veneno de Bothrops jararaca, entretanto, as atividades observadas para serino proteases e fosfolipases A2 foram comparáveis à atividade observada em venenos de serpentes Bothrops, conhecidas pela sua forte atividade anticoagulante e miotóxica devido a presença de serino proteases e fosfolipases A2, respectivamente. Esses resultados validam as propriedades funcionais das proteínas caracterizadas previamente pelo proteoma e fornecem um melhor entendimento do arsenal tóxico desse animal peçonhento pouco explorado, indicando o papel das serino proteases e fosfolipases A2 na ação do veneno.

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The snake venom metalloproteinases (SVMPs) are abundant enzymes in the venoms of viper snakes and responsible for most of the symptoms of envenoming. Their actions are related to the hydrolysis of extracellular matrix components, plasma proteins and hydrolysis or binding to cell surface proteins resulting in the activation or inhibition of their activity. In previous studies we recently found a diversity of SVMPs transcripts produced after stimulation of Bothrops neuwiedi venom gland. In this work, our aim was to characterize the different metalloproteinases in the Bothrops neuwiedi venom affecting hemostasis. Initially, the presence of distinct SVMPs in the venom was accessed by twodimensional electrophoresis and reverse phase chromatography. To obtain fractions enriched with SVMPs and characterize their functional activities, the venom was fractionated into molecular exclusion column, associated with anion exchange column and the resulting pools tested for enzymatic, hemorrhagic and fibrinolytic activities, blood clotting, reactivity with anti-SVMPs antibodies and mass spectrometry. This approach allowed the identification of six SVMPs, four class P-III and two class P-I. The SVMPs class P-III had gelatinolytic and hemorrhagic activities, of these, two had yet fibrinolytic activity. The two P-I were only fibrinolytic. Regarding coagulation activity, at least one P-III was characterized as prothrombin activator and one P-III as factor X activator. We conclude that there is a high variety of SVMPs in Bothrops neuwiedi snake venom, which disturb different hemostatic mechanisms and contribute to symptoms caused by this snake envenoming.

As metaloproteinases de venenos de serpentes (SVMPs) são enzimas abundantes em venenos de espécies da família Viperidae e responsáveis por grande parte dos sintomas do envenenamento. Sua ação está relacionada com a proteólise dos componentes da matriz extracelular, proteínas plasmáticas e também com hidrólise ou ligação a proteínas de superfície celular induzindo a ativação ou inibição da atividade das mesmas. Em estudos com serpentes do “Complexo Bothrops neuwiedi”, verificamos recentemente a diversidade dos transcritos de SVMPs produzidos após estímulo da glândula de veneno. Neste trabalho, o principal objetivo foi caracterizar as diferentes metaloproteinases presentes no veneno de Bothrops neuwiedi com ações na hemostasia. Inicialmente, confirmamos a presença de distintas SVMPs no veneno através de eletroforese bidimensional e cromatografia em coluna de fase reversa. Para a obtenção de frações enriquecidas com SVMPs e caracterização de suas atividades funcionais, o veneno foi fracionado em coluna de exclusão molecular, associado à coluna de troca aniônica e os pools resultantes testados quanto às atividades enzimática, hemorrágica, fibrinolítica, coagulante, reatividade com anticorpos anti-SVMPs e espectrometria de massas. Dessa forma, foi possível a identificação de seis pools contendo SVMPs, sendo quatro da classe P-III e dois da classe P-I. As SVMPs de classe P-III apresentaram atividades gelatinolítica e hemorrágica, destas, duas ainda apresentaram atividade fibrinolítica. As duas P-I foram apenas fibrinolíticas. Com relação à atividade coagulante, foram caracterizadas ao menos uma P-III ativadora de protrombina e uma P-III ativadora de fator X. Com isso concluímos que há grande variedade de SVMPs no veneno de Bothrops neuwiedi, as quais agem em diferentes mecanismos hemostáticos e contribuem para os sintomas causados nos envenenamentos por essa serpente.

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Proteolytic enzymes have a fundamental role in many biological processes and are associated with multiple pathological conditions. Therefore, targeting these enzymes may be important for a better understanding of their function and development of therapeutic inhibitors. Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) peptides are convenient tools for the study of peptidases specificity as they allow monitoring of the reaction on a continuous basis, providing a rapid method for the determination of enzymatic activity. Hydrolysis of a peptide bond between the donor/acceptor pair generates fluorescence that permits the measurement of the activity of nanomolar concentrations of the enzyme. The assays can be performed directly in a cuvette of the fluorimeter or adapted for determinations in a 96-well fluorescence plate reader. The synthesis of FRET peptides containing ortho-aminobenzoic acid (Abz) as fluorescent group and 2, 4-dinitrophenyl (Dnp) or N-(2, 4-dinitrophenyl)ethylenediamine (EDDnp) as quencher was optimized by our group and became an important line of research at the Department of Biophysics of the Federal University of São Paulo. Recently, Abz/Dnp FRET peptide libraries were developed allowing high-throughput screening of peptidases substrate specificity. This review presents the consolidation of our research activities undertaken between 1993 and 2008 on the synthesis of peptides and study of peptidases specificities.

As enzimas proteolíticas têm um papel fundamental em muitos processos biológicos e estão associadas a vários estados patológicos. Por isso, o estudo da especificidade das peptidases pode ser importante para uma melhor compreensão da função destas enzimas e para o desenvolvimento de inibidores. Os substratos com supressão intramolecular de fluorescência constituem uma excelente ferramenta, pois permitem o monitoramento da reação de forma contínua, proporcionando um método prático e rápido para a determinação da atividade enzimática. A hidrólise de qualquer ligação da cadeia peptídica entre o grupo doador e o grupo supressor gera fluorescência que permite detectar concentração nanomolar de enzima. Os ensaios podem ser acompanhados diretamente na cubeta ou adaptados para determinações de fluorescência em leitoras de placa. A síntese dos peptídeos com supressão intramolecular de fluorescência contendo o grupo fluorescente Abz (orto-aminobenzóico) e o grupo supressor EDDnp (N-[2, 4-dinitrofenil]-etilenodiamino ou Dnp (2, 4-dinitrophenyl) foi otimizada pelo nosso grupo e tornou-se uma importante linha de pesquisa no Departamento de Biofísica da Universidade Federal de São Paulo. Recentemente, foram desenvolvidas bibliotecas de peptídeos fluorogênico contendo Abz/Dnp como grupo doador/supressor trazendo um grande avanço no estudo de especificidade das peptidases. Esta revisão apresenta o trabalho desenvolvido pelo nosso grupo entre 1993 e 2008 sobre a síntese de peptídeos e o estudo da especificidade de peptidases.

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Este trabalho teve o objetivo de avaliar o efeito da adição da transglutaminase microbiana (MTGase) na fabricação de pão de forma, através do desenvolvimento de formulação ideal, com combinações de aditivos e enzima, e da avaliação do efeito da enzima nas proteínas, na massa crua, na massa após a fermentação e no produto final. Para comparar a qualidade dos pães produzidos com ou sem enzima, foram testadas três formulações: a básica, livre de aditivos (pão Zero); com a adição de emulsificante e ácido ascórbico (pão Controle); e a preparada com a formulação básica adicionada de enzima (pão MTGase). A avaliação da qualidade dos pães foi feita por meio de medidas físicas e instrumentais. A análise de textura foi realizada pelo método TPA (Texture Profíle Analysis), cujas respostas de firmeza, elasticidade, mastigabilidade e gomosidade podem ser correlacionadas com análises sensoriais. Paralelamente, de amostras de farinha, de massa e de pão foram obtidas as frações protéicas de gliadinas, gluteninas e os resíduos de extração. As gliadinas e as gluteninas foram analisadas por cromatografia líquida de alta eficiência em fase reversa e por eletroforese em gel de poliacrilamida contendo SDS. Os resultados de volume e de firmeza dos diferentes pães apresentaram diferenças significativas a nível de 5%, em que as respostas do pão MTGase foram melhores que as do pão Zero, porém ainda inferiores às do Controle. A melhor formulação foi obtida por meio de um planejamento composto central, com variações nas concentrações de emulsificante, ácido ascórbico e enzima, com os resultados avaliados pela metodologia de superfície de resposta. Exceto para a coesividade, todos os outros parâmetros de volume, dureza (TA), firmeza, elasticidade, mastigabilidade e gomosidade (TPA) apresentaram resultados positivos pela ação da transglutaminase a 0,6%, combinada com 0,2 % de emulsificante e 70 ppm de ácido ascórbico. Os resultados sugerem que a enzima foi capaz de modificar as propriedades químicas das proteínas, o comportamento reológico da massa e as propriedades funcionais do pão, melhorando a força da massa, a textura e o volume dos pães. As análises das frações gliadínicas apresentaram cerca de 3% de Nitrogênio total, em base seca, e as frações glutenínicas apresentaram entre 2 e 5% de Nitrogênio total. Os perfis cromatográficos e eletroforéticos dessas frações sugerem que as gliadinas não foram afetadas pela presença da enzima, que envolveram sobretudo as gluteninas. O conjunto de resultados indica que a aplicação de MTGase em associação com aditivos convencionais pode ser uma alternativa à panificação, embora os mecanismos de sua ação na massa não estejam completamente esclarecidos

The application of microbial transglutaminase on weak gluten flour used in breadmaking was studied over the process. To verify the enzyme effects, three formulations were tested: Base formulation, characterized by the absence of enzyme and emulsifying agents; Control formulation, comprised by the presence of emulsifying agents and ascorbic acid and MTGase formulation, with the enzyme. Samples of flour, dough and bread were analyzed. The effect of enzyme on bread quality was estimated by parameters of Texture Analysis, Texture Profile Analysis and specific volume. The protein contents from those samples were determined by the total nitrogen in glutenin and gliadin fractions, that were also analyzed by RP-HPLC (reversed phase high performance liquid chromatography) and by SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis). Although the MTGase bread did not reach the same quality parameters as those achieved by the Control samples, it showed as an alternative formulation to reduce the quantity of emulsifying agents and ascorbic acid as compared to the Control. The results indicate that the enzyme modified chemical and functional properties of glutenin fraction, improving dough strength and bread volume. Results of total nitrogen content, and electrophoretic and chromatographic profiles of the protein fractions suggest that while glutenin proteins were modified by enzyme, gliadin proteins were not affected

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During the fattening period (4 months) of 24 young bovines, male, Friesian, fed only concentrates, the behaviour of the levels of proteolytic enzymes was studied. The variation of the serical trypsin, chymotrypsin and amylase activity was observed, and it is probably due to the specifical effect of adaptation to the nutritions conditions. The serical trypsin activity was larger than the chymotrypsins. On the other hand, the behaviour of the enzymatic activity of trypsin and chymotrypsin in the feces decreased during the fattening. Small variations were observed in the groups of ponderal increment of the serical trypsin and amylase activities. By the method of gelatin digestion, the trypsin from the duodenal juice and feces presented total enzymatic activity up to the dilutions 1 : 4,0 and 1 : 1, respectively. By the colorimetric method the duodenal juice presented tryptical activity up to the dilution 1 : 200. Between the animals and the different groups of ponderal increment there were differences statistically significant for the values of serical trypsin, chymotrypsin and amylase. The mean values in terms of standard deviations were: serical trypsin 1,37 ± 0,066 mU/ml; trypsin in feces 0,39 ± 0,438 mU/ml; chymotrypsin 1,23 ± ± 0,064, mU/ml and serical amylase 154,61 ± 3,984 units.

Estudou-se, durante o período de engorda (4 meses) em 24, bovinos jovens, machos inteiros da raça holandesa preto e branco, alimentados exclusivamente com concentrados, o comportamento dos teores de enzimas proteolíticas. Observou-se variação da atividade da tripsina, da quimotripsina e da amilase séricas, provavelmente devidas a um efeito específico de adaptação às condições alimentares. A atividade da tripsina sérica foi maior do que a da quimotripsina; por outro lado o comportamento da atividade enzimática da tripsina nas fezes e da quimotripsina sofreu ligeira queda durante a fase de engorda. Observaram-se pequenas oscilações nos diferentes grupos de incremento ponderai para as atividades da tripsina e da amilase séricas. Pelo método da digestão da gelatina, a tripsina do suco duodenal e das fezes, apresentou atividade enzimática total até a diluição de 1 : 40 e 1 : 1 respectivamente. O suco duodenal dosado pelo método colorimétrico apresentou atividade triptica até a diluição 1:200. Entre os animais e os diferentes grupos de incremento ponderai houve diferenças estatisticamente significantes para os valores da tripsina, quimotripsina e amilase séricas. Os valores médios em termos de desvio padrão da média foram: Tripsina sérica 1,37 ± 0,066 mU/ml; Tripsina nas fezes 0,39 ± 0,438 mU/ml; Quimotripsina 1,23 ± ± 0,064, mU/ml; Amilase sérica 154,61 ± ± 3,984 unidades.

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During the fattening period (4 months) of 24 young bovines, male, Friesian, fed only concentrates, the behaviour of the levels of proteolytic enzymes was studied. The variation of the serical trypsin, chymotrypsin and amylase activity was observed, and it is probably due to the specifical effect of adaptation to the nutritions conditions. The serical trypsin activity was larger than the chymotrypsins. On the other hand, the behaviour of the enzymatic activity of trypsin and chymotrypsin in the feces decreased during the fattening. Small variations were observed in the groups of ponderal increment of the serical trypsin and amylase activities. By the method of gelatin digestion, the trypsin from the duodenal juice and feces presented total enzymatic activity up to the dilutions 1 : 4,0 and 1 : 1, respectively. By the colorimetric method the duodenal juice presented tryptical activity up to the dilution 1 : 200. Between the animals and the different groups of ponderal increment there were differences statistically significant for the values of serical trypsin, chymotrypsin and amylase. The mean values in terms of standard deviations were: serical trypsin 1,37 ± 0,066 mU/ml; trypsin in feces 0,39 ± 0,438 mU/ml; chymotrypsin 1,23 ± ± 0,064, mU/ml and serical amylase 154,61 ± 3,984 units.

Estudou-se, durante o período de engorda (4 meses) em 24, bovinos jovens, machos inteiros da raça holandesa preto e branco, alimentados exclusivamente com concentrados, o comportamento dos teores de enzimas proteolíticas. Observou-se variação da atividade da tripsina, da quimotripsina e da amilase séricas, provavelmente devidas a um efeito específico de adaptação às condições alimentares. A atividade da tripsina sérica foi maior do que a da quimotripsina; por outro lado o comportamento da atividade enzimática da tripsina nas fezes e da quimotripsina sofreu ligeira queda durante a fase de engorda. Observaram-se pequenas oscilações nos diferentes grupos de incremento ponderai para as atividades da tripsina e da amilase séricas. Pelo método da digestão da gelatina, a tripsina do suco duodenal e das fezes, apresentou atividade enzimática total até a diluição de 1 : 40 e 1 : 1 respectivamente. O suco duodenal dosado pelo método colorimétrico apresentou atividade triptica até a diluição 1:200. Entre os animais e os diferentes grupos de incremento ponderai houve diferenças estatisticamente significantes para os valores da tripsina, quimotripsina e amilase séricas. Os valores médios em termos de desvio padrão da média foram: Tripsina sérica 1,37 ± 0,066 mU/ml; Tripsina nas fezes 0,39 ± 0,438 mU/ml; Quimotripsina 1,23 ± ± 0,064, mU/ml; Amilase sérica 154,61 ± ± 3,984 unidades.