RESUMO

Tissue regeneration is widely studied due to its importance for understanding the biology of stem cells, aiming at their application in medicine for therapeutic and various other purposes. The establishment of experimental models is necessary, as certain invertebrates and vertebrates have different regeneration abilities depending on their taxon position on the evolutionary scale. Planarians are an efficacious in vivo model for stem cell biology, but the correlation between planarian cellular and molecular neoblast pluripotency mechanisms and those of mammalian stem cells is unknown. The present study had the following objectives: i) Establish Girardia tigrina cell culture, ii) determine the time required for complete cell disintegration and iii) obtain neoblasts by cell subdivision. Twenty-four specimens were deprived of food for seven days. After this time, disintegration was performed by incubation protected at three temperatures for 48 h in an antibiotic, antimycotic and trypsin solution, after which the suspension was homogenized and centrifuged. Histopaque® 1077 was used for cell separation and interphases were collected and monitored by optical and fluorescence microscopy. Optical microscopy analysis informed the nucleus-to-cytoplasm ratio, cell morphology and cell size. Under fluorescence microscopy, interphase 1 (I1) was subdivided into two groups and neoblasts were marked for characterization; one group was stained with 4',6-diamidino-2-phenylindole and the other was immunolabeled with octamer-binding transcription factor 4 (OCT4) and isolated and observed after 10 days of cultivation. Neoblasts predominated in I1 with a small amount of other cell types. In conclusion, sample disintegration with a trypsin and antibiotic solution was effective at 18˚C and Iscove's modified Dulbecco's medium supplemented with fetal bovine serum was adequate for the establishment of primary cell cultures after 48-h incubation and centrifugation. Antibody anti-OCT4 was used for the characterization of stem cells and was successfully labeled with concentrated neoblasts on interphase 1.

RESUMO

The mechanism of regeneration does not start to restore the wound until its corresponding epimorphic phase. A bioestimulation of tissues and cells by laser radiation depends on the wavelength, on the dose, and on the intensity of the light. The goal of this work was to verify the effect of the low power laser at 660 nm on the regenerative process of Girardia tigrina. The specimens were maintained in the laboratory under a temperature ranging from 19° up to 24 °C for 21 days. The planarians were anesthetized by placing them on ice and then cut them with a scalpel. The three treatments were as following: animals individually irradiated with 14 sessions with 1 minute duration (treatment 1), 14 sessions with 3 minutes duration (treatment 2), and without irradiation (control). The planarians were amputated and divided in three study treatments: a control group (without radiation), and two other treatments: irradiated for 1 minute, and irradiated for 3 minutes. The animals were irradiated with diode laser (660 nm) with 3.3 ± 0.3 mW of power, using 0.94 mW.mm-2 power density for each irradiation procedure. During the experiment, 14 irradiation sessions were undertaken. The specimens were fixed in Bouin, and stained with hematoxyline and eosin. From observation and histological analysis, it was possible to assess the effects of interaction between laser and tissue. The head fragment after 1 minute of irradiation presented a better organized tissue scheme, when compared with the other treatments. Aspects of the body fragments submitted to 3 minutes of light treatment were very similar to fragments that had not been injured. It can be concluded that there are changes in the quality of regeneration when treated with low power laser under the conditions mentioned above.

O mecanismo de regeneração não restaura a ferida até sua fase epimórfica correspondente. A bioestimulação de tecidos e células por radiação laser depende do comprimento de onda, da dose e intensidade de luz. O objetivo deste trabalho foi verificar o efeito do laser de baixa potência (660 nm) no processo regenerativo de Girardia tigrina. Estes vermes têm uma elevada capacidade de regeneração. Os espécimes foram mantidos em laboratório sob uma temperatura de 19° a 24 °C por 21 dias. As planárias foram anestesiadas com gelo e amputadas com bisturi. Os 3 tratamentos foram compostos de: animais individualmente irradiados com 14 sessões de 1 minuto de duração (tratamento 1), com 14 sessões de três minutos de duração (tratamento 2) e não irradiados (controle). Elas foram irradiadas com laser diodo (660 nm) 3,3 ± 0,3 mW potência, usando 0.94 mW.mm-2 de densidade de potência para cada irradiação. Durante o experimento foram realizadas 14 sessões. Os espécimes foram fixados em Bouin e corados com hematoxilina e eosina. Com base nas observações e análise histológica, foi possível avaliar os efeitos da interação entre laser e tecido. O fragmento cabeça após 1 minuto de irradiação mostrou um tecido melhor organizado quando comparado com outros tratamentos. Os aspectos dos fragmentos corpo após 3 minutos de irradiação foram muito similares para os fragmentos que não sofreram injúria. Existem mudanças na qualidade de regeneração quando tratadas com laser nas condições acima mencionadas.

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The mechanism of regeneration does not start to restore the wound until its corresponding epimorphic phase. A bioestimulation of tissues and cells by laser radiation depends on the wavelength, on the dose, and on the intensity of the light. The goal of this work was to verify the effect of the low power laser at 660 nm on the regenerative process of Girardia tigrina. The specimens were maintained in the laboratory under a temperature ranging from 19° up to 24 °C for 21 days. The planarians were anesthetized by placing them on ice and then cut them with a scalpel. The three treatments were as following: animals individually irradiated with 14 sessions with 1 minute duration (treatment 1), 14 sessions with 3 minutes duration (treatment 2), and without irradiation (control). The planarians were amputated and divided in three study treatments: a control group (without radiation), and two other treatments: irradiated for 1 minute, and irradiated for 3 minutes. The animals were irradiated with diode laser (660 nm) with 3.3 ± 0.3 mW of power, using 0.94 mW.mm-2 power density for each irradiation procedure. During the experiment, 14 irradiation sessions were undertaken. The specimens were fixed in Bouin, and stained with hematoxyline and eosin. From observation and histological analysis, it was possible to assess the effects of interaction between laser and tissue. The head fragment after 1 minute of irradiation presented a better organized tissue scheme, when compared with the other treatments. Aspects of the body fragments submitted to 3 minutes of light treatment were very similar to fragments that had not been injured. It can be concluded that there are changes in the quality of regeneration when treated with low power laser under the conditions mentioned above.

O mecanismo de regeneração não restaura a ferida até sua fase epimórfica correspondente. A bioestimulação de tecidos e células por radiação laser depende do comprimento de onda, da dose e intensidade de luz. O objetivo deste trabalho foi verificar o efeito do laser de baixa potência (660 nm) no processo regenerativo de Girardia tigrina. Estes vermes têm uma elevada capacidade de regeneração. Os espécimes foram mantidos em laboratório sob uma temperatura de 19° a 24 °C por 21 dias. As planárias foram anestesiadas com gelo e amputadas com bisturi. Os 3 tratamentos foram compostos de: animais individualmente irradiados com 14 sessões de 1 minuto de duração (tratamento 1), com 14 sessões de três minutos de duração (tratamento 2) e não irradiados (controle). Elas foram irradiadas com laser diodo (660 nm) 3,3 ± 0,3 mW potência, usando 0.94 mW.mm-2 de densidade de potência para cada irradiação. Durante o experimento foram realizadas 14 sessões. Os espécimes foram fixados em Bouin e corados com hematoxilina e eosina. Com base nas observações e análise histológica, foi possível avaliar os efeitos da interação entre laser e tecido. O fragmento cabeça após 1 minuto de irradiação mostrou um tecido melhor organizado quando comparado com outros tratamentos. Os aspectos dos fragmentos corpo após 3 minutos de irradiação foram muito similares para os fragmentos que não sofreram injúria. Existem mudanças na qualidade de regeneração quando tratadas com laser nas condições acima mencionadas.

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The embryonic development of freshwater triclads is mainly known from studies of species of Dendrocoelum, Planaria, Polycelis, and, more recently, Schmidtea. The present study characterizes the development of Girardia tigrina (Girard, 1850) by means of optical microcopy using glycol methacrylate semi-thin sections. 94 cocoons were collected in the period from laying to hatching, with intervals of up to twenty-four hours. The sequence of morphological changes occurring in the embryo permitted the identification of nine embryonic stages. At the time of cocoon laying, numerous embryos were dispersed among many yolk cells, with a rigid capsule covering the entire cocoon. In the first stage (approx. up to 6 hours after cocoon laying), yolk cells and embryonic cells showed random distribution. Stage II (between 12 and 24 hours after cocoon laying) is characterized by aggregates of blastomeres, which later aggregate forming an enteroblastula. Approximately 2 days after cocoon laying (stage III), formation of the embryonic epidermis and embryonic digestive system took place, the latter degenerating during the subsequent stage. Stage V (until the fourth day) is characterized by the formation of the definitive epidermis. Between 4 and 6 days after laying, organogenesis of the definitive inner organs starts (stage VI). Approximately 14 days after laying (stage IX), formation of the nervous system is completed. At this stage, the embryo shows similar characteristics to those of newly hatched juveniles. The hatching of Girardia tigrina occurs in the period between twelve to twenty-two days after cocoon laying.

O desenvolvimento embrionário dos tricladidos é conhecido, fundamentalmente, por estudos realizados em espécies de Dendrocoelum, Planaria, Polycelis e, mais recentemente, Schmidtea. O presente estudo descreve o desenvolvimento embrionário de Girardia tigrina (Girard, 1850), a partir de análises realizadas em cortes histológicos seriados e semifinos de glicol-metacrilato, ao microscópio óptico. Noventa e quatro casulos foram coletados no período entre a postura e a eclosão, em intervalos de até vinte e quatro horas. A seqüência das modificações morfológicas no embrião permitiu a identificação de nove estágios embrionários. Na postura dos casulos, envoltos por uma cápsula rígida, observam-se numerosos embriões dispersos entre grande quantidade de células vitelinas. No estágio I (aproximadamente até 6 horas após a postura), as células vitelinas e as embrionárias mostram uma distribuição aleatória. O estágio II (entre 12 e 24 horas após a postura) caracteriza-se pela formação de agrupamentos de blastômeros, os quais posteriormente formam uma enteroblástula. Aproximadamente dois dias após a postura (estágio III), ocorre a formação da epiderme e do sistema digestivo embrionário, sendo que este último degenera no estágio seguinte. O estágio V (até o quarto dia após a postura) caracteriza-se pela formação da epiderme definitiva. Entre o quarto e o sexto dia posteriores à postura, começa a organogênese dos órgãos internos definitivos (estágio VI). Aproximadamente catorze dias após a postura (estágio IX), completa-se a formação do sistema nervoso. Neste estágio, o embrião já apresenta características similares aos espécimes juvenis. A eclosão de Girardia tigrina ocorre entre doze e vinte e dois dias após a postura dos casulos.

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The embryonic development of freshwater triclads is mainly known from studies of species of Dendrocoelum, Planaria, Polycelis, and, more recently, Schmidtea. The present study characterizes the development of Girardia tigrina (Girard, 1850) by means of optical microcopy using glycol methacrylate semi-thin sections. 94 cocoons were collected in the period from laying to hatching, with intervals of up to twenty-four hours. The sequence of morphological changes occurring in the embryo permitted the identification of nine embryonic stages. At the time of cocoon laying, numerous embryos were dispersed among many yolk cells, with a rigid capsule covering the entire cocoon. In the first stage (approx. up to 6 hours after cocoon laying), yolk cells and embryonic cells showed random distribution. Stage II (between 12 and 24 hours after cocoon laying) is characterized by aggregates of blastomeres, which later aggregate forming an enteroblastula. Approximately 2 days after cocoon laying (stage III), formation of the embryonic epidermis and embryonic digestive system took place, the latter degenerating during the subsequent stage. Stage V (until the fourth day) is characterized by the formation of the definitive epidermis. Between 4 and 6 days after laying, organogenesis of the definitive inner organs starts (stage VI). Approximately 14 days after laying (stage IX), formation of the nervous system is completed. At this stage, the embryo shows similar characteristics to those of newly hatched juveniles. The hatching of Girardia tigrina occurs in the period between twelve to twenty-two days after cocoon laying.

O desenvolvimento embrionário dos tricladidos é conhecido, fundamentalmente, por estudos realizados em espécies de Dendrocoelum, Planaria, Polycelis e, mais recentemente, Schmidtea. O presente estudo descreve o desenvolvimento embrionário de Girardia tigrina (Girard, 1850), a partir de análises realizadas em cortes histológicos seriados e semifinos de glicol-metacrilato, ao microscópio óptico. Noventa e quatro casulos foram coletados no período entre a postura e a eclosão, em intervalos de até vinte e quatro horas. A seqüência das modificações morfológicas no embrião permitiu a identificação de nove estágios embrionários. Na postura dos casulos, envoltos por uma cápsula rígida, observam-se numerosos embriões dispersos entre grande quantidade de células vitelinas. No estágio I (aproximadamente até 6 horas após a postura), as células vitelinas e as embrionárias mostram uma distribuição aleatória. O estágio II (entre 12 e 24 horas após a postura) caracteriza-se pela formação de agrupamentos de blastômeros, os quais posteriormente formam uma enteroblástula. Aproximadamente dois dias após a postura (estágio III), ocorre a formação da epiderme e do sistema digestivo embrionário, sendo que este último degenera no estágio seguinte. O estágio V (até o quarto dia após a postura) caracteriza-se pela formação da epiderme definitiva. Entre o quarto e o sexto dia posteriores à postura, começa a organogênese dos órgãos internos definitivos (estágio VI). Aproximadamente catorze dias após a postura (estágio IX), completa-se a formação do sistema nervoso. Neste estágio, o embrião já apresenta características similares aos espécimes juvenis. A eclosão de Girardia tigrina ocorre entre doze e vinte e dois dias após a postura dos casulos.

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Girardia biapertura was described with sperm ducts penetrating the penis bulb, subsequently opening separately at the tip of the penis papilla and receiving the abundant secretion of penial glands. In the present work, the penial glands of this species have been histologically and histochemically analysed, and four types of secretory cells are distinguished. The openings of the penial glands into the intrabulbar and intrapapillar sperm ducts, designated here as intrapenial ducts, allow for the distinction between three histologically differentiated regions. The most proximal region possibly corresponds to the bulbar cavity of other freshwater triclads whereas the median and distal portions correspond to the ejaculatory duct. The proximal region of the intrapenial ducts receives mainly the openings of a secretory cell type (type I) that produces a proteinaceous secretion. A second type of secretory cell (type II) that secretes neutral mucopolyssacharides opens into the median region of the intrapenial ducts. The distal portion of the ducts receives two types of secretory cells (types III and IV) which secret glycoprotein and glycosaminoglycans, respectively. Types III and IV open also directly into the male atrium through the epithelium of the penis papilla. A comparison with the results presented here and those of other authors for species of Girardia is provided and the importance of the study of the penial glands for taxonomic characterisation of freshwater triclads is emphasised.

A espécie Girardia biapertura apresenta, segundo sua descrição original, ductos espermáticos penetrando o bulbo penial e, subseqüentemente, desembocando separadamente na ponta da papila penial e recebendo abundante secreção das glândulas peniais. No presente trabalho, as glândulas peniais dessa espécie foram analisadas histológica e histoquimicamente, sendo constatados quatro tipos de células secretoras. A desembocadura das glândulas peniais nas porções intrabulbar e intrapapilar dos ductos espermáticos, aqui designados como ductos intrapeniais, permite diferenciar três regiões histologicamente distintas. A região mais proximal desses ductos provavelmente corresponde à cavidade bulbar, enquanto as porções média e distal, ao ducto ejaculatório de outros tricladidos. A região proximal dos ductos intrapeniais recebe principalmente a desembocadura de um tipo de célula secretora (tipo I), cuja secreção é protéica. Na região média dos ductos intrapeniais desemboca um segundo tipo de célula secretora (tipo II), contendo mucopolissacarídeos neutros. A porção mais distal dos ductos intrapeniais recebe a desembocadura de dois tipos de células secretoras (tipos III e IV) que secretam glicoproteína e glicosaminoglicanas, respectivamente. As células dos tipos III e IV desembocam, também, diretamente no átrio masculino através do epitélio de revestimento da papila penial. Comparam-se os resultados obtidos com aqueles de outros autores para espécies do gênero Girardia e enfatiza-se a importância do estudo das glândulas peniais para a caracterização taxonômica das espécies de tricladidos dulcícolas.

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Girardia biapertura was described with sperm ducts penetrating the penis bulb, subsequently opening separately at the tip of the penis papilla and receiving the abundant secretion of penial glands. In the present work, the penial glands of this species have been histologically and histochemically analysed, and four types of secretory cells are distinguished. The openings of the penial glands into the intrabulbar and intrapapillar sperm ducts, designated here as intrapenial ducts, allow for the distinction between three histologically differentiated regions. The most proximal region possibly corresponds to the bulbar cavity of other freshwater triclads whereas the median and distal portions correspond to the ejaculatory duct. The proximal region of the intrapenial ducts receives mainly the openings of a secretory cell type (type I) that produces a proteinaceous secretion. A second type of secretory cell (type II) that secretes neutral mucopolyssacharides opens into the median region of the intrapenial ducts. The distal portion of the ducts receives two types of secretory cells (types III and IV) which secret glycoprotein and glycosaminoglycans, respectively. Types III and IV open also directly into the male atrium through the epithelium of the penis papilla. A comparison with the results presented here and those of other authors for species of Girardia is provided and the importance of the study of the penial glands for taxonomic characterisation of freshwater triclads is emphasised.

A espécie Girardia biapertura apresenta, segundo sua descrição original, ductos espermáticos penetrando o bulbo penial e, subseqüentemente, desembocando separadamente na ponta da papila penial e recebendo abundante secreção das glândulas peniais. No presente trabalho, as glândulas peniais dessa espécie foram analisadas histológica e histoquimicamente, sendo constatados quatro tipos de células secretoras. A desembocadura das glândulas peniais nas porções intrabulbar e intrapapilar dos ductos espermáticos, aqui designados como ductos intrapeniais, permite diferenciar três regiões histologicamente distintas. A região mais proximal desses ductos provavelmente corresponde à cavidade bulbar, enquanto as porções média e distal, ao ducto ejaculatório de outros tricladidos. A região proximal dos ductos intrapeniais recebe principalmente a desembocadura de um tipo de célula secretora (tipo I), cuja secreção é protéica. Na região média dos ductos intrapeniais desemboca um segundo tipo de célula secretora (tipo II), contendo mucopolissacarídeos neutros. A porção mais distal dos ductos intrapeniais recebe a desembocadura de dois tipos de células secretoras (tipos III e IV) que secretam glicoproteína e glicosaminoglicanas, respectivamente. As células dos tipos III e IV desembocam, também, diretamente no átrio masculino através do epitélio de revestimento da papila penial. Comparam-se os resultados obtidos com aqueles de outros autores para espécies do gênero Girardia e enfatiza-se a importância do estudo das glândulas peniais para a caracterização taxonômica das espécies de tricladidos dulcícolas.