RESUMO
RESUMEN Objetivo. Determinar la estructura genética de las cepas drogorresistentes de Mycobacterium tuberculosis que circularon en todo el Perú durante los años 2011-2015 a través de haplotipos obtenidos de un ensayo con sondas en línea. Materiales y métodos. Se analizaron 6589 muestras que ingresaron al Instituto Nacional de Salud para el diagnóstico rutinario mediante el ensayo GenoType® MTBDRplus v2, durante el periodo de estudio. Se crearon haplotipos resistentes mediante la concatenación de 21 sitios polimórficos de los genes evaluados por el ensayo con sondas en línea, y se realizó el análisis de asociación con fenotipos obtenidos por el método de proporciones agar 7H10. Resultados. Las mutaciones de mayores frecuencias fueron: rpoB S531L (55,4%) y rpoB D516V (18,5%) para la resistencia a rifampicina, y katG S315T (59,5%) e inhA c-15t (25,7%) para la resistencia a isoniacida. Se obtuvieron 13 haplotipos representativos (87,8% de muestras analizadas) de los cuales seis correspondieron al genotipo multidrogorresistente, cuatro al genotipo monorresistente a isoniacida y tres al genotipo monorresistente a rifampicina. Dieciocho departamentos, y la provincia del Callao, presentaron una alta diversidad haplotípica; cuatro presentaron moderada diversidad y dos presentaron baja diversidad. Conclusiones. Existe una alta diversidad haplotípica en la mayoría de los departamentos, además de una concentración de las cepas de Mycobacterium tuberculosis drogorresistentes en las ciudades de Lima y Callao. Asimismo, las cepas de Mycobacterium tuberculosis con perfil drogorresistente que circulan en el Perú contienen principalmente los marcadores genéticos de mayor prevalencia a nivel mundial asociados con la resistencia frente a rifampicina e isoniacida.
ABSTRACT Objective. To determine the genetic structure of drug-resistant strains of Mycobacterium tuberculosis that circulated throughout Peru during the years 2011-2015, by using haplotypes obtained from a line probe assay. Materials and methods. A total of 6589 samples that were admitted to the Instituto Nacional de Salud for routine diagnosis using the GenoType® MTBDRplus v2 assay were analyzed during the study period. Resistant haplotypes were created by concatenating 21 polymorphic sites of the evaluated genes using the line probe assay; and the association analysis was carried out with phenotypes obtained by the 7H10 agar ratio method. Results. The most frequent mutations were: rpoB S531L (55.4%) and rpoB D516V (18.5%) for rifampicin resistance, and katG S315T (59.5%) and inhA c-15t (25.7%) for isoniazid resistance. We obtained 13 representative haplotypes (87.8% of analyzed samples), 6 corresponded to the multidrug-resistant genotype, 4 to the isoniazid mono-resistant genotype and 3 to the rifampicin mono-resistant genotype. Eighteen regions and the province of Callao showed high haplotype diversity; four showed moderate diversity and two showed low diversity. Conclusions. Most regions showed high haplotype diversity; in addition, most drug-resistant strains of Mycobacterium tuberculosis were concentrated in the cities of Lima and Callao. Likewise, drug-resistant Mycobacterium tuberculosis strains circulating in Peru mainly contain the genetic markers with the highest prevalence worldwide, which are associated with resistance to rifampicin and isoniazid.
Assuntos
Tuberculose , Haplótipos , Resistência a Medicamentos , Mycobacterium tuberculosis , Peru , Variação Genética , DNA Bacteriano , Mutação Puntual , Epidemiologia Molecular , Técnicas de Diagnóstico Molecular , Serviços Laboratoriais de Saúde Pública , GenótipoRESUMO
As infecções relacionadas à assistência à saúde (IRAS) são eventos adversos preocupantes em saúde pública, que se configuram como importante causa de morbidade e mortalidade em unidades de terapia intensiva. Dispositivos invasivos como o cateter venoso central (CVC) favorecem um tipo de IRAS, a infecção da corrente sanguínea. Esse evento é comumente diagnosticado por hemocultura e ou cultura da ponta do cateter, entretanto nem sempre o tempo de resposta dos exames ou os achados contribuem com o adequado tratamento. Os avanços em biotecnologia apontam ferramentas capazes de contribuir com diagnósticos de infecção. O objetivo da presente tese foi testar a técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR) como ferramenta para detecção de bactérias potencialmente patogênicas em ponta de CVC de pacientes com suspeita de infecção da corrente sanguínea relacionada ao cateter, internados na Unidade de Terapia Intensiva de Adultos de um hospital filantrópico e de ensino no interior de Minas Gerais. Foram abordados os temas extração de DNA e rastreamento molecular em CVC. Tratou-se de um estudo molecular, transversal, descritivo e exploratório. Testes laboratoriais de comparação entre métodos de extração de DNA foram realizados com cepa da bactéria Staphylococcus aureus para posterior aplicação em cateteres coletados de pacientes. Durante um período de seis meses, uma amostra de conveniência com trinta e quarto cateteres removidos de pacientes internados na Unidade de Terapia Intensiva de Adultos, sob suspeita de infecção da corrente sanguínea, foram submetidos à extração de DNA do material biológico contido na parede externa e no interior dos lúmens dos mesmos. Procedeu-se a identificação de bactérias por PCR utilizando um padrão de reagentes e temperaturas. Os resultados encontrados na análise por biologia molecular foram comparados com os resultados das culturas desses pacientes, realizadas pelo hospital. Houve ainda, o levantamento em prontuário de dados dos pacientes: sexo, idade, uso de outros dispositivos invasivos, tempo de permanência do CVC e local de inserção do cateter; e presença de sinais flogísticos no local de inserção do dispositivo. Testes estatísticos com auxílio do programa Stata, versão 15, foram utilizados. A prevalência das bactérias no CVC por teste de PCR foi: Staphylococcus aureaus (50%), Enterococcus faecalis (41,2%), Klebsiella pneumoniae (32,4%), Pseudomonas aeruginosa (20,6%), Acinetobacter baumannii (38,2%) e Escherichia coli (2,9%). Todas as hemoculturas realizadas tiveram ausência de bactérias como resultado do exame. A cultura de ponta de cateter revelou bactérias em 21 (61,8%) dispositivos, enquanto a PCR apresentou positividade em 31 (91,2%). Os patógenos mais detectados são comumente encontrados no ambiente e no microbioma humano, transmitidos aos pacientes inclusive pelas mãos dos profissionais de saúde. Estes achados são relevantes ao se programar medidas de prevenção de infecção da corrente sanguínea relacionada ao CVC. O método de extração do material genômico, o painel de primers e protocolo de amplificação deste estudo identificaram os principais bactérias comumente prevalentes nas infecções da corrente sanguínea. Desta forma, a identificação molecular de bactérias poderá auxiliar na detecção de infecção da corrente sanguínea e a tomada de decisão relativa à escolha da melhor terapia.
Healthcare-associated infections (HAIs) are worrying adverse events in public health. They are an important cause of morbidity and mortality in intensive care units. Invasive devices such as the central venous catheter (CVC) favors a type of HAIs, the bloodstream infection. This event is commonly diagnosed by blood culture and/or culture of the catheter tip, however, the response time of these tests or their results not always contribute to the appropriate treatment. Advances in biotechnology provide tools capable of contributing to diagnoses of infection. The aim of the present thesis was to detect potentially pathogenic bacteria at the tip of a central venous catheter through polymerase chain reaction (PCR). Subjects were treated with DNA extraction and molecular tracing in CVC. It is a cross-sectional molecular study. Laboratory tests comparing DNA extraction methods were performed with the Staphylococcus aureus bacterium for subsequent application to catheters collected from patients. Over a period of 6 months, in an Adult Intensive Care Unit of a philanthropic and training hospital, (n=34) catheters were removed from patients under suspicion of bloodstream infection. All the thirty-four catheters were subjected to DNA extraction from the biological material contained in their wall and inside their lumens. The bacteria were identified by PCR using a standard set of reagents and temperatures. The results found in the analysis by molecular biology were compared with the results of the cultures of these patients, performed by the hospital. Collection of patients' data was also carried out: sex, age, use of other invasive devices, CVC insertion location and period of catheters use; and presence of phlogistic signs in the insertion site of the device. Statistical tests were used with the help of the Stata software, version 15. The prevalence of bacteria in CVCs was: Staphylococcus aureaus (50%), Enterococcus faecalis (41,2%), Klebsiella pneumoniae (32,4%), Pseudomonas aeruginosa (20,6%), Acinetobacter baumannii (38,2%) and Escherichia coli (2,9%). All blood cultures performed had no bacteria as a result of the examination. Catheter-tip culture revealed microorganisms in 21 (61.8%) devices, whereas PCR showed positivity in 31 (91.2%). The most commonly detected pathogens are usually found in the environment and in the microbioma of the skin and they are possibly transmitted to patients by the hands of health professionals. These findings are relevant when programming CVC-related bloodstream infection prevention measures. The genomic material extraction method, primers panel and amplification protocol of this study identified the major pathogens prevalent in bloodstream infections. In this way, molecular identification of bacteria may assist in the detection of bloodstream infection and decision-making regarding the choice of the best therapy.