RESUMO

A clorofilina cúprica de sódio (CuChl) é um corante semissintético derivado da clorofila. Quimicamente é constituído de diversas clorinas, em especial a clorina cúprica e4 (CuCe4), a clorina cúprica e6 (CuCe6), e possíveis clorinas e porfirinas não cúpricas em proporções variáveis. Além do seu uso como corante alimentar, são atribuídas atividades biológicas à CuChl, tais como, antimutagênica, anticarcinogênica e antioxidante. Em decorrência destes potenciais efeitos benéficos, sua comercialização sob a forma de suplementos é crescente. Todavia, curiosamente, informações sobre a absorção e biodisponibilidade da CuChl são escassas. Além disso, até o momento nenhum estudo avaliou o impacto da composição da CuChl em sua bioatividade e eficácia. Assim, o presente estudo teve como objetivo identificar e caracterizar quimicamente duas amostras de CuChl (Sigma® e Chr. Hansen®) e o padrão de CuCe6 (Frontier Scientific®). Para tanto, empregou-se técnicas cromatográficas e espectrofotométricas, determinou-se a lipofilicidade em modelos miméticos de membrana, cinética de degradação e avaliou-se a interação CuCe6/BSA. A análise elementar da CuChl resultou em teores de cobre total inferiores aos recomendados pela United States Pharmacopeia (U.S.P.). Os elementos (CHN) e a razão Cu/N não foram coerentes com os valores teóricos da molécula de CuChl. Apenas uma amostra de CuChl apresentou razão Soret/Q dentro dos valores preconizados pela U.S.P. A titulação base-ácido da CuCe6 revelou dois valores de pkas (10,62 e 6,41) que foram similares para as amostras de CuChl. A determinação de log P da CuCe6 mostrou que a hidrofobicidade é máxima em pH 3 (log P = 1,49±0,09) e sua hidrofilicidade ocorre em pHs > 7. Esse comportamento foi confirmado nos ensaios de incorporação em lipossomas em função do pH. A degradação térmica da CuChl (25 a 95 °C) avaliada por HPLC foi drástica a partir de 75 °C. A energia necessária para que ocorra a degradação da CuChl e CuCe6 é Ea = 16,1 e 9,3kcal/mol, respectivamente. A meia-vida a 35 °C é de 6 horas para a CuChl e 2 horas e meia para a CuCe6. A separação mais eficiente dos componentes da CuChl por HPLC foi conseguida utilizando coluna C30 e a identificação dos principais constituintes CuCe6, CuCe4 e a clorina cúprica p6 (CuCp6), ocorreu por HPLC/MSMS. No estudo da ligação entre CuCe6 e proteína BSA foram obtidos os valores de KD = 0,38 ± 0,07 µM, KA = 3,3 ± 0,28 x 106 M-1 e número de sítios de ligação ~1 (N = 0,75 ± 0,09), indicativo de alta afinidade entre a clorina e a proteína. Assim, o comportamento químico dos principais componentes da CuChl e sua interação com os componentes do soro tornaram inviáveis a identificação e quantificação destas moléculas em ensaios in vivo. Os resultados aqui apresentados servem de subsídio para o desenvolvimento de outras pesquisas que visem o estudo específico da associação e dissociação da CuChl em material biológico

Sodium copper chlorophyllin (CuChl) is a semisynthetic derivative of chlorophyll dye. It is composed chemically by several chlorins, especially copper chlorin e4 (CuCe4), copper chlorin e6 (CuCe6), and possible others no copper porphyrins and chlorins in different proportions. In addition to its use as a food coloring, CuChl may have interesting biological effects as antimutagenic, anticarcinogenic and antioxidant. Because of these potential benefits, its use as a dietary supplement is increasing. However, information on the absorption and bioavailability of CuChl is scarce. Furthermore, no studies have evaluated the impact of CuChl composition in its bioactivity and efficacy. Thus, the present study aimed to identify and chemically characterize two samples of CuChl (Sigma® and Hansen®) and the standard of CuCe6 (Frontier Scientific®). Chromatographic and spectrometric techniques as well as mimetics models membrane were used. The CuCe6/BSA interaction was also evaluated. The elemental analysis of CuChl showed that the total copper content of it was smaller that the one recommended by United States Pharmacopeia (USP). The elements (CHN) and the ratio Cu / N were not consistent with the theoretical values of the molecule CuChl. Only one CuChl sample showed Soret / Q ratio within the range recommended by USP. The acid-base titration of CuCe6 revealed two pKas values (10.62 and 6.41), which were similar for CuChl samples. The log P determination of CuCe6 showed that its hydrophobicity is maximal at pH 3 (log P = 1.49 ± 0.09) and its hydrophilicity occurs at pH> 7. These results were confirmed using the incorporation into liposomes assay in function of pH. Using HPLC, it was observed that thermal degradation of CuChl (25 to 95 °C) hardly occurred from 75 °C. The energy necessary for CuChl and CuCe6 degradation is Ea = 16.1 and 9.3 kcal/mol, respectively. The half-life at 35°C for CuChl and CuCe6 is 6 hours and 2 ½ hours, respectively. A more efficient separation of the CuChl components by HPLC was achieved using a C30 column while its major constituents CuCe6, CuCe4 and copper chlorin p6 (CuCp6) were identified by HPLC / MS-MS. In binding analysis of CuCe6 and BSA, it was observed KD = 0.38 ± 0.07 mM, KA = 3.3 ± 0.28 x 106 M-1, and number of binding sites ~ 1 (N = 0.75 ± .09), indicating high affinity between BSA and chlorine. Thus, due to the chemical characteristics of the main components of CuChl and their interaction with serum components the identification and quantification of these molecules in vivo is unviable. Future studies should investigate the association and dissociation of CuChl in biological samples

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A clorofilina (CHLN), derivado sintético da clorofila com atividade antimutagênica, foi analisada quanto a sua atividade antiviral para o poliovírus em culturas de células HEp-2. A droga foi avaliada quanto às atividades virucida, profilática e terapêutica na multiplicação do poliovirus em culturas de célulasHEp-2, nas concentrações de 0,5 e 2,5 µg/mL. A inibição do título viral e a reação de imunofluorescência foram utilizadas para avaliação. A CHLN inibiu a multiplicação do poliovírus nos três protocolos de tratamento, porém foi mais efetiva no tratamento virucida inibindo em 95,7 por cento a multiplicação viral na concentração de 2,5 µg/mL. A CHLN reduziu o número de células infectadas com fluorescência específica, nos tratamentos virucida, e terapêutico, 8h e 10h pós-infecção, nas duas concentrações (0,5e 2,5 µg/mL) . Sugere-se que a CHLN tem uma ação direta na partícula viral ou provavelmente age nos estágios iniciais da multiplicação do poliovirus.

Chlorophyllin (CHLN), a semisynthetic derivative of chlorophyll with antimutagenic properties, wasassayed for its antiviral effect on the replication of poliovirus in cell culture. The drug was tested forthe virucide, prophylactic and therapeutic activities on the replication of the poliovirus in HEp-2 cellscultures, at concentrations of 0.5 and 2.5 µg/mL. Virus titration and an indirect immunofluorescencetest were used for the evaluation. The CHLN inhibited poliovirus replication in all treatment protocols;however, it was more effective on virucide treatment, with a 95.7 percent reduction in viral multiplication atconcentration of 2.5 µg/mL. CHLN reduced the number of specifically fluorescent infected cells in bothvirucide and therapeutic treatments, 8h and 10h post-infection, at both concentrations (0.5 and 2.5 µg/mL). It is suggested that CHLN either has a direct action on the virus particles or acts on the initial stage of the polivirus replication.

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Dezessete amostras de corante urucum, 6 de cúrcuma, 9 de cochonilha, 10 de vermelho de beterraba, 4 de antocianinas de casca de uva e 4 de clorofilina cúprica, num total de 50 amostras de corantes naturais, foram analisadas para verificar se estes corantes atendiam às Normas de Identidade e Qualidade estabeleci das pela "Food Agricultural Organization/World Health Organization". Para todas as amostras foram traçados espectros de absorção na região do ultravioleta e visível para caracterização do corante natural. Também foram pesquisadas impurezas, tais como arsênico e chumbo, além de adulterantes, como corantes artificiais. Do total de 50 amostras analisadas, 20 apresentaram especificações fora dos padrões de Identidade e Qualidade da "FAO/WHO", bem como dos padrões propostos nas monografias de um grupo brasileiro de estudo de corantes naturais para alimentos (AU).

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