RESUMO
The objective of the present study was to verify the sex ratio and presence of DNA fragmentation by TUNEL technique (In situ terminal deoxinucleotidyl transferase mediated dUTP nick end labeling assay) in bovine spermatozoa centrifuged in density gradients of Percoll or OptiPrep during the sperm separation. Approximately 40 million of frozen/thawed bovine spermatozoa were deposited on each density gradient composed of Percoll or OptiPrep with three layers ranging from 1.110g/mL to 1.123g/mL in polystyrene tubes of 15mL. The tubes were kept at 4C for 24h before the deposition of sperm. Centrifugation of the tubes was performed at 500xg for 15min at 22C. Supernatants were aspirated and the sediment recovered for verification of DNA fragmentation by TUNEL technique. A deviation of in vitro produced embryos for females in Percoll gradient (62% females) was obtained in relation to OptiPrep and Control groups, (47.1 and 48.7% of females, respectively). No sperm DNA fragmentation was detect in centrifuged samples (Percoll or OptiPrep gradients). Thus, it was possible to sexing sperm, obtaining a higher percentage of X sperm than the control group, using a methodology that is simple and without damage to the sperm DNA.
O objetivo, neste trabalho, foi verificar o desvio da proporção de sexo e a presença de fragmentação do DNA, pela técnica de TUNEL (In situ terminal deoxinucleotidyl transferase mediated dUTP nick end labeling assay), em espermatozoides bovinos centrifugados em gradientes de densidade de Percoll ou OptiPrep durante a separação espermática. Doses de sêmen de touros foram descongeladas, e cerca de 40 milhões de espermatozoides foram depositados sobre cada gradiente de densidade compostos por Percoll ou OptiPrep com três camadas entre 1.110g/mL e 1.123g/mL, em tubos de 15mL, em que permaneceram por 24h a 4C antes da deposição dos espermatozoides. Os tubos foram centrifugados a 500xg por 15min a 22C. Os sobrenadantes foram aspirados, e os sedimentos, recuperados para verificação da fragmentação do DNA pela técnica de TUNEL. Obteve-se um desvio dos embriões produzidos in vitro para fêmeas no gradiente de Percoll (62% de fêmeas), em relação aos grupos OptiPrep e Controle (47,1 e 48,7% de fêmeas, respectivamente). Não foi detectada fragmentação do DNA dos espermatozoides nas amostras centrifugadas, tanto no gradiente de Percoll quanto de OptiPrep. Dessa forma, foi possível realizar a sexagem espermática, com uma maior porcentagem de espermatozoides X do que o grupo controle, por meio de metodologia mais simples e sem provocar danos ao DNA dos espermatozoides.
RESUMO
The objective of the present study was to verify the sex ratio and presence of DNA fragmentation by TUNEL technique (In situ terminal deoxinucleotidyl transferase mediated dUTP nick end labeling assay) in bovine spermatozoa centrifuged in density gradients of Percoll or OptiPrep during the sperm separation. Approximately 40 million of frozen/thawed bovine spermatozoa were deposited on each density gradient composed of Percoll or OptiPrep with three layers ranging from 1.110g/mL to 1.123g/mL in polystyrene tubes of 15mL. The tubes were kept at 4C for 24h before the deposition of sperm. Centrifugation of the tubes was performed at 500xg for 15min at 22C. Supernatants were aspirated and the sediment recovered for verification of DNA fragmentation by TUNEL technique. A deviation of in vitro produced embryos for females in Percoll gradient (62% females) was obtained in relation to OptiPrep and Control groups, (47.1 and 48.7% of females, respectively). No sperm DNA fragmentation was detect in centrifuged samples (Percoll or OptiPrep gradients). Thus, it was possible to sexing sperm, obtaining a higher percentage of X sperm than the control group, using a methodology that is simple and without damage to the sperm DNA.
O objetivo, neste trabalho, foi verificar o desvio da proporção de sexo e a presença de fragmentação do DNA, pela técnica de TUNEL (In situ terminal deoxinucleotidyl transferase mediated dUTP nick end labeling assay), em espermatozoides bovinos centrifugados em gradientes de densidade de Percoll ou OptiPrep durante a separação espermática. Doses de sêmen de touros foram descongeladas, e cerca de 40 milhões de espermatozoides foram depositados sobre cada gradiente de densidade compostos por Percoll ou OptiPrep com três camadas entre 1.110g/mL e 1.123g/mL, em tubos de 15mL, em que permaneceram por 24h a 4C antes da deposição dos espermatozoides. Os tubos foram centrifugados a 500xg por 15min a 22C. Os sobrenadantes foram aspirados, e os sedimentos, recuperados para verificação da fragmentação do DNA pela técnica de TUNEL. Obteve-se um desvio dos embriões produzidos in vitro para fêmeas no gradiente de Percoll (62% de fêmeas), em relação aos grupos OptiPrep e Controle (47,1 e 48,7% de fêmeas, respectivamente). Não foi detectada fragmentação do DNA dos espermatozoides nas amostras centrifugadas, tanto no gradiente de Percoll quanto de OptiPrep. Dessa forma, foi possível realizar a sexagem espermática, com uma maior porcentagem de espermatozoides X do que o grupo controle, por meio de metodologia mais simples e sem provocar danos ao DNA dos espermatozoides.
RESUMO
The aim of this study was to separate X-bearing bovine sperm by continuous Percoll and OptiPrep density gradients and to validate the sexing of resultant in vitro produced embryos by Polimerase Chain Reaction (PCR). Frozen/thawed sperm was layered on density gradients which were previously prepared in polystyrene tubes, 24 h before procedures and maintained at 4 C. The tubes were centrifuged at 500 x g for 15 min at 22 C. Supernatants were gently aspirated and the sperm recovered from the bottom of the tubes. Viability and integrity of sperm were evaluated by Trypan Blue/Giemsa stain. Cleavage and blastocyst rates were determined by in vitro production of embryos and PCR was performed for identification of the embryos genetic sex. No damage in viability and acrossomal integrity and in cleavage and blastocyst rates was found in the Percoll and OptiPrep treatment compared to the non-centrifuged group (P>0.05). The percentage of female embryos in the Percoll and OptiPrep group was 63.0 and 47.6%, respectively. The female embryos in control group were 48.7%. A sexual deviation in the Percoll density gradient was achieved without reduction of sperm viability and in vitro production rates.KEY WORDS: Bovine, centrifugation, in vitro production of embryos, PCR, X-bearing sperm.
O objetivo deste estudo foi separar espermatozoides bovinos portadores do cromossomo X pela centrifugação em gradiente de densidade contínuo de Percoll e OptiPrep, e validar a sexagem pela reação em cadeia da polimerase (PCR), dos embriões produzidos in vitro. Para a sexagem, espermatozoides descongelados foram depositados nos gradientes de densidade, previamente preparados, em tubos de poliestireno, 24 horas antes da sexagem e mantidos a 4C. Centrifugou-se a 500 x g por quinze minutos a 22C. Os sobrenadantes foram aspirados, e os espermatozoides recuperados do fundo dos tubos. Avaliaram-se a viabilidade e a integridade dos espermatozoides pela coloração Azul de Tripan/Giemsa e determinou-se a taxa de clivagem e de blastocisto pela produção in vitro dos embriões, identificando-se o sexo genético deste embriões pela PCR. Não foram detectados danos à viabilidade e à integridade acrossomal, nem nas taxas de clivagem e de blastocistos no grupo Percoll e OptiPrep em comparação com o grupo não centrifugado (P>0,05). A porcentagem de embriões fêmeas no grupo Percoll e OptiPrep foi de 63% e 47,6%, respectivamente, e no grupo controle foi de 48,7%. Houve um desvio na proporção sexual no gradiente de Percoll, sem redução da viabilidade espermática e das taxas de produção in vitro.PALAVRAS-CHAVES: Bovino, centrifugação, espermatozoides X, produção in vitro de embriões, PCR.
RESUMO
The aim of this study was to separate X-bearing bovine sperm by continuous Percoll and OptiPrep density gradients and to validate the sexing of resultant in vitro produced embryos by Polimerase Chain Reaction (PCR). Frozen/thawed sperm was layered on density gradients which were previously prepared in polystyrene tubes, 24 h before procedures and maintained at 4 C. The tubes were centrifuged at 500 x g for 15 min at 22 C. Supernatants were gently aspirated and the sperm recovered from the bottom of the tubes. Viability and integrity of sperm were evaluated by Trypan Blue/Giemsa stain. Cleavage and blastocyst rates were determined by in vitro production of embryos and PCR was performed for identification of the embryos genetic sex. No damage in viability and acrossomal integrity and in cleavage and blastocyst rates was found in the Percoll and OptiPrep treatment compared to the non-centrifuged group (P>0.05). The percentage of female embryos in the Percoll and OptiPrep group was 63.0 and 47.6%, respectively. The female embryos in control group were 48.7%. A sexual deviation in the Percoll density gradient was achieved without reduction of sperm viability and in vitro production rates.KEY WORDS: Bovine, centrifugation, in vitro production of embryos, PCR, X-bearing sperm.
O objetivo deste estudo foi separar espermatozoides bovinos portadores do cromossomo X pela centrifugação em gradiente de densidade contínuo de Percoll e OptiPrep, e validar a sexagem pela reação em cadeia da polimerase (PCR), dos embriões produzidos in vitro. Para a sexagem, espermatozoides descongelados foram depositados nos gradientes de densidade, previamente preparados, em tubos de poliestireno, 24 horas antes da sexagem e mantidos a 4C. Centrifugou-se a 500 x g por quinze minutos a 22C. Os sobrenadantes foram aspirados, e os espermatozoides recuperados do fundo dos tubos. Avaliaram-se a viabilidade e a integridade dos espermatozoides pela coloração Azul de Tripan/Giemsa e determinou-se a taxa de clivagem e de blastocisto pela produção in vitro dos embriões, identificando-se o sexo genético deste embriões pela PCR. Não foram detectados danos à viabilidade e à integridade acrossomal, nem nas taxas de clivagem e de blastocistos no grupo Percoll e OptiPrep em comparação com o grupo não centrifugado (P>0,05). A porcentagem de embriões fêmeas no grupo Percoll e OptiPrep foi de 63% e 47,6%, respectivamente, e no grupo controle foi de 48,7%. Houve um desvio na proporção sexual no gradiente de Percoll, sem redução da viabilidade espermática e das taxas de produção in vitro.PALAVRAS-CHAVES: Bovino, centrifugação, espermatozoides X, produção in vitro de embriões, PCR.