RESUMO

Para o sucesso da maturação in vitro (MIV), faz-se necessário uma sincronização entre as maturação nuclear e citoplasmática. Desta forma, o presente estudo teve por objetivo comparar o efeito do fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF) como fator de crescimento na maturação in vitro (MIV) de oócitos caprinos com os fatores de crescimento epidermal (EGF) e semelhante à insulina I (IGF-I) adicionados juntos. Complexos cúmulos oócito (CCOs) foram isolados por slicing de ovários caprinos (n=40) utilizando bisturi cirúrgico. Apenas oócitos ≥110 μm com citoplasma homogêneo circundado por pelo menos uma camada compacta e coesiva de células do cúmulus foram selecionados para MIV. O meio de cultivo de base foi o TCM199 suplementado com 1% de BSA, 5 g/mL de hormônio luteinizante (LH), 0,5 g/mL de hormônio folículo estimulante recombinante (rFSH®), 0,911 mMol/L de piruvato,1μg/mL de estradiol, e 100 μM de cisteamina, o qual foi denominado TCM199+. OsCCOs selecionados foram distribuídos aleatoriamente nos seguintes tratamentos: 1) EGF e IGF-I, TCM199+ Suplementado com 10 ng/mL de EGF e 50 ng/mL de IGF-I; 2) VEGF, TCM199+ suplementado com 100 ng/mL de VEGF. Após a MIV, foram utilizados marcadores fluorescentes para avaliar a configuração da cromatina (Hoechst) e a viabilidade oocitária (calceína-AM e etídio homodímero). De uma maneira geral, ambos os tratamentos VEGF (80.2 e 35.7%) e EGF e IGF-I (70.5 e 29.9%) apresentaram resultados similares de quebra da vesícula germinativa (GVBD) e metáfase II rates (MII), respectivamente, sendo o tratamento VEGF numericamente superior ao EGF e IGF-I. Desta forma, conclui-se que o VEGF atua de forma similar ao EGF e IGF-I na competência oocitária para retomar ameiose.

For successful IVM, oocytes must undergo synchronically nuclear and cytoplasmic maturation. Thus, the aim of the present study was to compare vascular endothelial growth factor (VEGF) as a growth factor to the in vitro maturarion (IVM) to caprine oocytes instead of epidermal growth factor (EGF) plus insulin like growth factor I (IGF-I).Then, cumulus oocyte complexes (COCs) were pooled from slicing of caprine ovaries (n=40) using a surgical blade. Only oocytes ≥110 μm with homogeneous cytoplasm and surrounded by at least one compact layer of shiny and cohesive cumulus cells were selected to the IVM. The basic culture medium consisted of TCM199 supplemented with 1% of BSA, 5 g/mL of luteinizing hormone (LH), 0.5 g/mL of recombinant follicle-stimulanting hormone (rFSH®), 0.911 mMol/L pyruvate,1 μg/mL estradiol, and 100 μM cysteamine named TCM199+. The selected COCs were randomly distributed in the following treatments: 1) EGF plus IGF-I, TCM199+supplemented with 10 ng/ml of EGF and 50 ng/mL of IGF-I; 2) VEGF, TCM199+supplemented only with 100ng/mL of recombinant VEGF-A. After the IVM, oocytes were stained with fluorescent markers for the assessment of chromatin configuration (Hoechst) and to evaluate oocyte viability (calcein-AM and ethidium homodimer). Overall, both VEGF (80.2 and 35.7%) and EGF plus IGF-I (70.5 and 29.9%) treatments presented similar results of germinal vesicle breakdown (GVBD) and metaphase II rates (MII), respectively, being VEGF numerically greater than EGF plus IGF-I. Thus, we can infer that VEGF may act similar to EGF plus IGF-I in in vitro oocyte competence to resumes meiosis.

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RESUMO

Para o sucesso da maturação in vitro (MIV), faz-se necessário uma sincronização entre as maturação nuclear e citoplasmática. Desta forma, o presente estudo teve por objetivo comparar o efeito do fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF) como fator de crescimento na maturação in vitro (MIV) de oócitos caprinos com os fatores de crescimento epidermal (EGF) e semelhante à insulina I (IGF-I) adicionados juntos. Complexos cúmulos oócito (CCOs) foram isolados por slicing de ovários caprinos (n=40) utilizando bisturi cirúrgico. Apenas oócitos ≥110 μm com citoplasma homogêneo circundado por pelo menos uma camada compacta e coesiva de células do cúmulus foram selecionados para MIV. O meio de cultivo de base foi o TCM199 suplementado com 1% de BSA, 5 g/mL de hormônio luteinizante (LH), 0,5 g/mL de hormônio folículo estimulante recombinante (rFSH®), 0,911 mMol/L de piruvato,1μg/mL de estradiol, e 100 μM de cisteamina, o qual foi denominado TCM199+. OsCCOs selecionados foram distribuídos aleatoriamente nos seguintes tratamentos: 1) EGF e IGF-I, TCM199+ Suplementado com 10 ng/mL de EGF e 50 ng/mL de IGF-I; 2) VEGF, TCM199+ suplementado com 100 ng/mL de VEGF. Após a MIV, foram utilizados marcadores fluorescentes para avaliar a configuração da cromatina (Hoechst) e a viabilidade oocitária (calceína-AM e etídio homodímero). De uma maneira geral, ambos os tratamentos VEGF (80.2 e 35.7%) e EGF e IGF-I (70.5 e 29.9%) apresentaram resultados similares de quebra da vesícula germinativa (GVBD) e metáfase II rates (MII), respectivamente, sendo o tratamento VEGF numericamente superior ao EGF e IGF-I. Desta forma, conclui-se que o VEGF atua de forma similar ao EGF e IGF-I na competência oocitária para retomar ameiose.(AU)

For successful IVM, oocytes must undergo synchronically nuclear and cytoplasmic maturation. Thus, the aim of the present study was to compare vascular endothelial growth factor (VEGF) as a growth factor to the in vitro maturarion (IVM) to caprine oocytes instead of epidermal growth factor (EGF) plus insulin like growth factor I (IGF-I).Then, cumulus oocyte complexes (COCs) were pooled from slicing of caprine ovaries (n=40) using a surgical blade. Only oocytes ≥110 μm with homogeneous cytoplasm and surrounded by at least one compact layer of shiny and cohesive cumulus cells were selected to the IVM. The basic culture medium consisted of TCM199 supplemented with 1% of BSA, 5 g/mL of luteinizing hormone (LH), 0.5 g/mL of recombinant follicle-stimulanting hormone (rFSH®), 0.911 mMol/L pyruvate,1 μg/mL estradiol, and 100 μM cysteamine named TCM199+. The selected COCs were randomly distributed in the following treatments: 1) EGF plus IGF-I, TCM199+supplemented with 10 ng/ml of EGF and 50 ng/mL of IGF-I; 2) VEGF, TCM199+supplemented only with 100ng/mL of recombinant VEGF-A. After the IVM, oocytes were stained with fluorescent markers for the assessment of chromatin configuration (Hoechst) and to evaluate oocyte viability (calcein-AM and ethidium homodimer). Overall, both VEGF (80.2 and 35.7%) and EGF plus IGF-I (70.5 and 29.9%) treatments presented similar results of germinal vesicle breakdown (GVBD) and metaphase II rates (MII), respectively, being VEGF numerically greater than EGF plus IGF-I. Thus, we can infer that VEGF may act similar to EGF plus IGF-I in in vitro oocyte competence to resumes meiosis.(AU)

Assuntos

RESUMO

A regulação da foliculogênese é um processo complexo regulado por vários fatores intra e extraovarianos. A resposta das células ovarianas ao estímulo produzido por esses fatores depende da transdução de sinais no interior das células através de várias vias de sinalização. A interação entre as diversas vias de sinalização celular e a descoberta constante de novas vias demonstram a complexidade desse processo. A presente revisão se propõe a descrever os principais fatores reguladores da foliculogênese, seus receptores e as vias de sinalização celular destacando pontos de interação entre elas. Em adição, uma análise crítica dos principais resultados obtidos com o cultivo in vitro de folículos ovarianos murinos, bovinos, caprinos e ovinos levando-se em consideração as substâncias presentes nos meios de cultivo utilizados e as prováveis vias de sinalização celular empregadas é apresentada na presente revisão.(AU)

Folliculogenesis is regulated by a complex process, which involves several intra- and extraovarian factors. The response of the ovarian cells to those factors depends on the signal transduction inside the cells through several signaling pathways. The interaction of different signaling pathways and discovery of new pathways demonstrate the complexity of folliculogenesis. Therefore, this review will highlight the main regulatory factors that control folliculogenesis, their receptors and sharing signaling pathways. Moreover, a critical analysis about the main results from in vitro follicle culture studies in murine, bovine, caprine, and ovine, focusing on the medium supplements and the interactions of their signaling pathways will be presented. (AU)

Assuntos

RESUMO

A regulação da foliculogênese é um processo complexo regulado por vários fatores intra e extraovarianos. A resposta das células ovarianas ao estímulo produzido por esses fatores depende da transdução de sinais no interior das células através de várias vias de sinalização. A interação entre as diversas vias de sinalização celular e a descoberta constante de novas vias demonstram a complexidade desse processo. A presente revisão se propõe a descrever os principais fatores reguladores da foliculogênese, seus receptores e as vias de sinalização celular destacando pontos de interação entre elas. Em adição, uma análise crítica dos principais resultados obtidos com o cultivo in vitro de folículos ovarianos murinos, bovinos, caprinos e ovinos levando-se em consideração as substâncias presentes nos meios de cultivo utilizados e as prováveis vias de sinalização celular empregadas é apresentada na presente revisão.

Folliculogenesis is regulated by a complex process, which involves several intra- and extraovarian factors. The response of the ovarian cells to those factors depends on the signal transduction inside the cells through several signaling pathways. The interaction of different signaling pathways and discovery of new pathways demonstrate the complexity of folliculogenesis. Therefore, this review will highlight the main regulatory factors that control folliculogenesis, their receptors and sharing signaling pathways. Moreover, a critical analysis about the main results from in vitro follicle culture studies in murine, bovine, caprine, and ovine, focusing on the medium supplements and the interactions of their signaling pathways will be presented.

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OBJECTIVE: Evaluate the possible role of IGF-II alone or in association with FSH on in vitro development of isolated caprine preantral follicles. METHODS: Preantral follicles (≥150 µm) were isolated from goat ovaries and cultured for 18 days in basic αMEM medium (control) or supplemented with IGF-II alone at 20 or 50 ng/ml, named IGF20 and IGF50, respectively, or in combination with recombinant FSH (FSH, IGF20F or IGF50F). During in vitro culture, the follicles were analyzed by using morphology criteria, antrum formation and growth rate as parameters. After 18 days of follicular culture, oocytes equal to or larger than 110 µm were used for in vitro maturation (IVM). Oocyte viability and meiosis resumption were assessed by fluorescence microscopy after labeling with calcein-AM, ethidium homodimer and Hoechst 33342. RESULTS: The IGF20 treatment was the only treatment capable of maintaining the percentage of morphologically normal follicles from D0 until D6 and from D12 to D18 (p>0.05), while in all other treatments the percentage of morphologically normal follicles decreased progressively during 18 days of in vitro culture (p<0.05). At D18, all treatments with IGF-II or FSH resulted in a significantly higher percentage of normal follicles when compared to αMEM alone. The IGF50F treatment provided a significantly higher early antrum formation rate when compared to αMEM and FSH alone. The addition of IGF-II alone (20 or 50 ng/ml) or in combination with FSH prevented oocyte degeneration after IVM. Moreover, the FSH treatment demonstrated a lower percentage of oocyte degeneration when compared to control (4.35% vs. 26.3%, respectively; p<0.05). Regarding meiosis resumption, the IGF20F treatment was the only treatment that significantly differed from αMEM alone. All treatments except the control (αMEM alone) presented oocytes at metaphase II. CONCLUSION: IGF-II associated with FSH stimulated in vitro follicular development, oocyte viability and meiotic resumption of caprine oocytes after IVM.

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RESUMO

A produção in vitro de embriões em cães pode auxiliar na compreensão de inúmeros fenômenos fisiológicos como o crescimento, a maturação e a fecundação de oócitos e ainda se apresenta como alternativa para contornar obstáculos reprodutivos inerentes à espécie. Além disso, os conhecimentos adquiridos com esta técnica podem ser utilizados para a preservação de cães selvagens ameaçados de extinção. Entretanto a existência de diferenças na fisiologia reprodutiva canina quando comparado aos demais mamíferos domésticos, resulta em uma dificuldade em maiores avanços na produção in vitro de embriões nessa espécie. Nesse sentido inúmeros estudos vêm sendo realizados para desenvolver biotécnicas que venham a auxiliar na compreensão da fisiologia reprodutiva canina, bem como tentar solucionar o entrave da produção in vitro de embriões. Dessa forma, esta revisão tem como objetivo, relatar os avanços obtidos até o momento no crescimento e maturação in vitro de oócitos de cães domésticos, assim como discorrer sobre as estratégias utilizadas até o presente momento para aumentar a produção in vitro de embriões caninos, utilizando-se oócitos oriundos tanto de folículos pré-antrais como de folículos antrais.

The in vitro embryo production in dogs can help the understanding of several physiological processes such as growth, maturation and fertilization of oocytes, and also represents an alternative to overcome reproductive obstacles in this species. Moreover, the knowledge obtained from this technique can be used for the preservation of endangered wild dogs However, the existence of differences between dogs and other domestic species regarding the reproductive physiology in these species difficult major advances in the in vitro embryo production in dogs. In this regard, many studies were conducted to developing biotechniques which will help to understand the canine reproductive physiology, as well as to try to solve the obstacle on in vitro production of embryon. Thus, this review aims to address the progress obtained so far in the in vitro growth and maturation of oocytes from domestic dogs, as to address the strategies used until the present moment to improve the in vitro production of canine embryo, using oocyte from both preantral and antral follicles.

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A produção in vitro de embriões em cães pode auxiliar na compreensão de inúmeros fenômenos fisiológicos como o crescimento, a maturação e a fecundação de oócitos e ainda se apresenta como alternativa para contornar obstáculos reprodutivos inerentes à espécie. Além disso, os conhecimentos adquiridos com esta técnica podem ser utilizados para a preservação de cães selvagens ameaçados de extinção. Entretanto a existência de diferenças na fisiologia reprodutiva canina quando comparado aos demais mamíferos domésticos, resulta em uma dificuldade em maiores avanços na produção in vitro de embriões nessa espécie. Nesse sentido inúmeros estudos vêm sendo realizados para desenvolver biotécnicas que venham a auxiliar na compreensão da fisiologia reprodutiva canina, bem como tentar solucionar o entrave da produção in vitro de embriões. Dessa forma, esta revisão tem como objetivo, relatar os avanços obtidos até o momento no crescimento e maturação in vitro de oócitos de cães domésticos, assim como discorrer sobre as estratégias utilizadas até o presente momento para aumentar a produção in vitro de embriões caninos, utilizando-se oócitos oriundos tanto de folículos pré-antrais como de folículos antrais.(AU)

The in vitro embryo production in dogs can help the understanding of several physiological processes such as growth, maturation and fertilization of oocytes, and also represents an alternative to overcome reproductive obstacles in this species. Moreover, the knowledge obtained from this technique can be used for the preservation of endangered wild dogs However, the existence of differences between dogs and other domestic species regarding the reproductive physiology in these species difficult major advances in the in vitro embryo production in dogs. In this regard, many studies were conducted to developing biotechniques which will help to understand the canine reproductive physiology, as well as to try to solve the obstacle on in vitro production of embryon. Thus, this review aims to address the progress obtained so far in the in vitro growth and maturation of oocytes from domestic dogs, as to address the strategies used until the present moment to improve the in vitro production of canine embryo, using oocyte from both preantral and antral follicles.(AU)

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The aim of this study was to evaluate the influence of the number of follicles per drop (one or three) and antral follicles on in vitro development of isolated goat preantral follicles. Preantral follicles were isolated through microdissection and distributed individually (control) or in groups of three follicles (treatment) in microdroplets of α-MEM with or without 1000 ng/ml follicle stimulating hormone (FSH) for Experiments 1 and 2, respectively. Experiment 3 was divided into four treatments according to the presence of one or three preantral follicles, associated or not with antral follicles. After culture, oocytes were retrieved from morphologically normal follicles and submitted to in vitro maturation (IVM) and live/dead fluorescent labelling. Results of Experiment 1 (basic medium without FSH) showed that culture of preantral follicles in groups enhances viability, growth and antrum formation after 12 days. However, in the presence of FSH (Experiment 2), only the recovery rate of fully grown oocytes for IVM was significantly affected by grouping of follicles. In Experiment 3, in general, co-culture of preantral follicles with an early antral follicle had a detrimental effect on viability, antrum formation and production of oocytes for IVM. In conclusion, the performance of in vitro culture of goat preantral follicles is affected by the number of follicles per drop, the presence of an antral follicle and FSH.

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RESUMO

The objective was to evaluate the effects of various concentrations of exogenous FSH during in vitro culture of isolated canine preantral follicles. Preantral secondary follicles (>200 microm) were isolated by microdissection and cultured for 18 d in supplemented alpha-Minimum Essential Medium (alpha-MEM). There were three treatment groups: 1) absence of FSH (control medium); 2) FSH100 (fixed concentration of 100 ng/mL throughout the entire culture period); and 3) sequential FSH (FSHSeq - 100, 500, and 1,000 ng/mL were added sequentially). Following culture, all follicles from all treatments were still viable (marked green by calcein-AM). The initial (D0) average follicle diameter for the control, FSH100, and FSHSeq was (mean +/- SEM) 298.96 +/- 7.02, 286.00 +/- 5.87, and 275.39 +/- 174 6.55 microm, respectively (P > 0.05). Mean diameter of follicles treated with FSHSeq on Day 18 (D18-439.80 +/- 14.08 microm) was greater than those of the other treatments (P < 0.05). Daily follicular growth rate (microm/d) of follicles in the FSHSeq treatment (6.47 +/- 0.55) was significantly faster than for both the control (3.67 +/- 0.32) and FSH100 (4.47 +/- 0.38) treatments. Furthermore, FSH100 and FSHSeq treatments had a significantly higher rate of antrum formation than the control group on D12 of culture, whereas after D12, FSH100 had a significantly higher rate of extrusion compared to the control (P < 0.05). In conclusion, the sequential addition of FSH to the culture medium maintained the survival of isolated canine preantral follicles and promoted an increased rate of follicular growth and antrum formation.

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This study was conducted in order to verify the effect of different concentrations of BMP-7 in the in vitro survival and development of caprine preantral follicles. Fragments of caprine ovarian cortical tissue were cultured for 1 or 7 days in Minimum Essential Medium (MEM+) supplemented with different concentrations of BMP-7 (1, 10, 50 or 100ng/ml). Non-cultured fragments or those cultured for 1 or 7 days were processed for classical histology and transmission electron microscopy (TEM). Parameters such as follicular survival, activation and growth were evaluated. The results showed that, after 1 or 7 days of culture, the percentage of morphologically normal follicles was significantly reduced in all treatments when compared with fresh control, except at 1ng/ml of BMP-7 for 1 day. In addition, the concentration of 10ng/ml of BMP-7 significantly increases follicular diameter from day 1 to 7 of culture. There was no influence of the other concentrations of BMP-7 regarding to the follicular and oocyte diameter. Ultrastructure studies confirmed follicular integrity after 7 days of culture in 1ng/ml BMP-7. In conclusion, small concentrations of BMP-7 can improve the survival and growth of caprine preantral follicles during in vitro culture.

O presente trabalho foi conduzido de modo a se verificar o efeito de diferentes concentrações da BMP-7 no desenvolvimento in vitro de folículos pré-antrais caprinos. Fragmentos de tecido cortical ovariano caprino foram cultivados por 1 ou 7 dias em Minimum Essential Medium (MEM+) suplementado com diferentes concentrações de BMP-7 (1, 10, 50 ou 100ng/ml). Os fragmentos não cultivados ou aqueles cultivados por 1 ou 7 dias foram processados para histologia clássica e microscopia eletrônica de transmissão (TEM), sendo avaliados parâmetros morfológicos indicativos de viabilidade, ativação e crescimento. Os resultados mostraram que o percentual de folículos morfologicamente normais diminuiu significativamente em todos os tratamentos quando comparados ao controle, exceto na concentração de 1ng/ml por 1 dia de cultivo. Já no D7 todos os tratamentos reduziram significativamente os percentuais de folículos morfologicamente normais. Utilizando 10ng/ml de BMP-7 foi observado um aumento significativo no diâmetro folicular quando comparados os diferentes períodos de cultivo. Não houve influência das demais concentrações de BMP-7 quando avaliados além do diâmetro folicular o diâmetro oocitário. A análise por TEM confirmou a integridade ultra-estrutural nos folículos após 7 dias de cultivo com 1ng/ml de BMP-7 . Em conclusão, o BMP-7 em baixas concentrações pode melhorar a sobrevivência e o crescimento durante o cultivo in vitro de folículos pré-antrais caprinos.

Assuntos

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This study was conducted in order to verify the effect of different concentrations of BMP-7 in the in vitro survival and development of caprine preantral follicles. Fragments of caprine ovarian cortical tissue were cultured for 1 or 7 days in Minimum Essential Medium (MEM+) supplemented with different concentrations of BMP-7 (1, 10, 50 or 100ng/ml). Non-cultured fragments or those cultured for 1 or 7 days were processed for classical histology and transmission electron microscopy (TEM). Parameters such as follicular survival, activation and growth were evaluated. The results showed that, after 1 or 7 days of culture, the percentage of morphologically normal follicles was significantly reduced in all treatments when compared with fresh control, except at 1ng/ml of BMP-7 for 1 day. In addition, the concentration of 10ng/ml of BMP-7 significantly increases follicular diameter from day 1 to 7 of culture. There was no influence of the other concentrations of BMP-7 regarding to the follicular and oocyte diameter. Ultrastructure studies confirmed follicular integrity after 7 days of culture in 1ng/ml BMP-7. In conclusion, small concentrations of BMP-7 can improve the survival and growth of caprine preantral follicles during in vitro culture.(AU)

O presente trabalho foi conduzido de modo a se verificar o efeito de diferentes concentrações da BMP-7 no desenvolvimento in vitro de folículos pré-antrais caprinos. Fragmentos de tecido cortical ovariano caprino foram cultivados por 1 ou 7 dias em Minimum Essential Medium (MEM+) suplementado com diferentes concentrações de BMP-7 (1, 10, 50 ou 100ng/ml). Os fragmentos não cultivados ou aqueles cultivados por 1 ou 7 dias foram processados para histologia clássica e microscopia eletrônica de transmissão (TEM), sendo avaliados parâmetros morfológicos indicativos de viabilidade, ativação e crescimento. Os resultados mostraram que o percentual de folículos morfologicamente normais diminuiu significativamente em todos os tratamentos quando comparados ao controle, exceto na concentração de 1ng/ml por 1 dia de cultivo. Já no D7 todos os tratamentos reduziram significativamente os percentuais de folículos morfologicamente normais. Utilizando 10ng/ml de BMP-7 foi observado um aumento significativo no diâmetro folicular quando comparados os diferentes períodos de cultivo. Não houve influência das demais concentrações de BMP-7 quando avaliados além do diâmetro folicular o diâmetro oocitário. A análise por TEM confirmou a integridade ultra-estrutural nos folículos após 7 dias de cultivo com 1ng/ml de BMP-7 . Em conclusão, o BMP-7 em baixas concentrações pode melhorar a sobrevivência e o crescimento durante o cultivo in vitro de folículos pré-antrais caprinos.(AU)

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