RESUMO
The objective of this study was to determine the effect of different centrifugation forces in bovine sperm separation by discontinuous Percoll gradients for in vitro fertilization IVF. The semen samples from each bull were pooled or each bull were centrifuged separately and centrifuged in discontinuous Percoll gradients (30, 60 and 90%) at different forces: F1 (9000×g), F2 (6500×g), F3 (4500×g) and F4 (2200×g), according experiment. The sperm samples were evaluated to determine the concentration, motility, vigor, morphology, reactive oxygen species (ROS), integrity of the plasma membrane, lipid peroxidation, antioxidants and embryo development were also evaluated. No difference was observed in the concentration of sperm submitted to different centrifugation forces. The total percentage of motile sperm was increased after centrifugation at F3 and F4, and the ROS production at F1 was greater than the other forces. When the bulls semen were processed individually, no significant differences were observed for the sperm quality parameters between F1 and F4, including lipid peroxidation, antioxidants, cleavage rate and average time to the first cleavage. This work demonstrated for the first time that centrifugation at 2200×g enhanced the sperm penetration and fertilization rates without reducing sperm recovery compared to the typical centrifugation force (9000×g) currently used by the commercial bovine IVF industry.
Assuntos
Bovinos/fisiologia , Centrifugação com Gradiente de Concentração/veterinária , Fertilização in vitro/veterinária , Povidona , Dióxido de Silício , Espermatozoides/fisiologia , Animais , Bovinos/embriologia , Centrifugação com Gradiente de Concentração/métodos , Feminino , Masculino , Estresse Oxidativo , Espécies Reativas de Oxigênio/metabolismo , Análise do Sêmen/veterinária , Espermatozoides/citologiaRESUMO
Objetivou-se modificar o método de mini-Percoll para seleção espermática e redução da formação de ROS em espermatozoides bovinos. Dez palhetas de sêmen de um touro Bos taurus foram descongeladas, avaliadas, divididas em duas frações e depositadas sob gradientes de Percoll 90 e 45% (controle) e Percoll 90, 60 e 30% (tratado), sendo centrifugados por cinco minutos a 9000 x G. Após lavagem, foram efetuadas a avaliação morfofuncional e a quantificação de ROS. A proporção de espermatozoides com defeitos no grupo-controle (13,5%) foi igual (P > 0,05) ao do tratado (12,5%). A recuperação de 65,5 e 67 x 106 espermatozoides/mL, a motilidade progressiva de 54 e 63% e a integridade de membrana 23,7 e 22% não diferiram (P > 0,05) entre os grupos controle e tratado, respectivamente. Foi observada menor (P < 0,05) formação de ROS no grupo-tratado (3,03 ± 1,43 UF), comparado ao grupo-controle (7,24 ± 1,38 UF). A seleção espermática por gradientes de 90, 60 e 30% não afetou a recuperação e a qualidade dos espermatozoides, mas apresentou menor produção de ROS. Com base nesses resultados, pode-se concluir que o uso desses gradientes é eficiente na separação espermática, os quais podem ser utilizados em programas de PIV de embriões bovinos.
The objective was to modify the method for mini Percoll sperm selection and reducing the formation of ROS in bovine spermatozoa. Ten straws of semen from a bull Bos taurus were thawed, evaluated, divided into two fractions and deposited in Percoll gradients of 90 and 45% (Control) and Percoll 90, 60 and 30% (Treated), and centrifuged for 5' to 9000 xG. After washing was performed morphofunctional evaluation and quantification of ROS. Was similar (P > 0.05) the proportion of sperm with defects in the Control group (13.5%) and Treated (12.5%). The recovery of 65.5 and 67 x106 spermatozoa/mL, progressive motility of 54 and 63% and membrane integrity of 23.7 and 22% did not differ (P > 0.05) between the Control and Treated group, respectively. A lower formation of ROS (P < 0.05) was observed in the Treated group (3.03 ± 1.43 FU) compared to Control group (7.24 ± 1.38 FU). The sperm selection by Percoll gradients of 90, 60 and 30% did not affect the recovery and quality of sperm but showed a lower production of ROS. Based on these results we can conclude that the use these gradients is effective to separate sperm, can be used in programs of bovine IVP.
Assuntos
Masculino , Animais , Bovinos , Espermatozoides/química , Espécies Reativas de Oxigênio/farmacologia , Fertilização in vitro/veterinária , Sêmen , Vírus da Imunodeficiência Felina , Controle da População/métodos , OócitosRESUMO
Objetivou-se modificar o método de mini-Percoll para seleção espermática e redução da formação de ROS em espermatozoides bovinos. Dez palhetas de sêmen de um touro Bos taurus foram descongeladas, avaliadas, divididas em duas frações e depositadas sob gradientes de Percoll 90 e 45% (controle) e Percoll 90, 60 e 30% (tratado), sendo centrifugados por cinco minutos a 9000 x G. Após lavagem, foram efetuadas a avaliação morfofuncional e a quantificação de ROS. A proporção de espermatozoides com defeitos no grupo-controle (13,5%) foi igual (P > 0,05) ao do tratado (12,5%). A recuperação de 65,5 e 67 x 106 espermatozoides/mL, a motilidade progressiva de 54 e 63% e a integridade de membrana 23,7 e 22% não diferiram (P > 0,05) entre os grupos controle e tratado, respectivamente. Foi observada menor (P < 0,05) formação de ROS no grupo-tratado (3,03 ± 1,43 UF), comparado ao grupo-controle (7,24 ± 1,38 UF). A seleção espermática por gradientes de 90, 60 e 30% não afetou a recuperação e a qualidade dos espermatozoides, mas apresentou menor produção de ROS. Com base nesses resultados, pode-se concluir que o uso desses gradientes é eficiente na separação espermática, os quais podem ser utilizados em programas de PIV de embriões bovinos. (AU)
The objective was to modify the method for mini Percoll sperm selection and reducing the formation of ROS in bovine spermatozoa. Ten straws of semen from a bull Bos taurus were thawed, evaluated, divided into two fractions and deposited in Percoll gradients of 90 and 45% (Control) and Percoll 90, 60 and 30% (Treated), and centrifuged for 5' to 9000 xG. After washing was performed morphofunctional evaluation and quantification of ROS. Was similar (P > 0.05) the proportion of sperm with defects in the Control group (13.5%) and Treated (12.5%). The recovery of 65.5 and 67 x106 spermatozoa/mL, progressive motility of 54 and 63% and membrane integrity of 23.7 and 22% did not differ (P > 0.05) between the Control and Treated group, respectively. A lower formation of ROS (P < 0.05) was observed in the Treated group (3.03 ± 1.43 FU) compared to Control group (7.24 ± 1.38 FU). The sperm selection by Percoll gradients of 90, 60 and 30% did not affect the recovery and quality of sperm but showed a lower production of ROS. Based on these results we can conclude that the use these gradients is effective to separate sperm, can be used in programs of bovine IVP. (AU)