RESUMO
BACKGROUND: Yerba mate (YM, Ilex paraguariensis) consumption beneficially affects the bones. However, whether YM components exert their effect on bone cells directly remains elusive. METHODS: We evaluated how main YM components affect osteoblastic (MC3T3-E1) and osteocytic (MLO-Y4) cells in vitro when administered separately or in an aqueous extract. MC3T3-E1 and MLO-Y4 cells were exposed to three different experimental conditions: (1) Caffeine, chlorogenic acid, and their combinations; (2) Caffeine, rutin, and their combinations; (3) Aqueous YM extract. RESULTS: All polyphenol and caffeine concentrations as well as that of their tested combinations significantly increased MC3T3-E1 cell viability from 16.6% to 34.8% compared to the control. In MLO-Y4 cells, the lowest rutin and the two highest caffeine concentrations significantly increased cell viability by 11.9, 14.9, and 13.7%, respectively. While rutin and caffeine combinations tended to increase MLO-Y4 cell viability, different chlorogenic acid and caffeine combinations did not affect it. Finally, the aqueous YM extract significantly increased MLO-Y4, MC3T3-E1, and differentiated MC3T3-E1 cell viability compared to the control without treatment. CONCLUSIONS: YM components (rutin, chlorogenic acid, and caffeine) positively affected bone cells, mainly pre-osteoblast cells. Moreover, the aqueous YM extract significantly increased MLO-Y4, MC3T3-E1, and differentiated MC3T3-E1 cell viabilities indicating an additional relevant nutritional property of YM infusion. Further studies would be required to elucidate the underlying effector mechanism of YM on the bones and its relationship with previously described in vivo positive effects.
RESUMO
Osteocytes are the most abundant bone cell and are formed when osteoblasts become embedded in the bone matrix. Through changes in gene expression and paracrine effects, osteocytes regulate the number of osteoblasts, bone forming cells, and osteoclasts, bone resorbing cells, which are needed to maintain bone mass. MLO-Y4 is the better characterized osteocytic cell line; however, lacks expression of sclerostin, the product of the SOST gene, which is fundamental for osteocyte function and blocks bone formation. With the objective to isolate MLO-Y4 clones with different gene expression profiles, we performed cultures at very low density of MLO-Y4 cells stably transfected with nuclear green fluorescent protein (MLOnGFP). Cell morphology was visualized under a fluorescence microscope. Once the cells reached 80% confluency, RNA was extracted and quantitative real time PCR was performed. Clones exhibit different sizes and morphology, with some cells showing a spindle-like shape and others with abundant projections and a star-like shape. Gene expression also differed among clones. However, none of the clones examined expressed SOST. We conclude that the MLO-nGFP clones constitute a useful tool to study osteocyte differentiation and the role of osteocytes in the control of bone formation and resorption in vitro. (AU)
Los osteocitos son las células más abundantes del hueso y se forman cuando los osteoblastos se encuentran rodeados de matriz ósea. A través de cambios en la expresión génica y efectos paracrinos, los osteocitos controlan el número de osteoblastos que forman el hueso, y osteoclastos que resorben el hueso, células necesarias para mantener la masa ósea. Las células MLO-Y4 son la línea celular osteocítica más investigada; sin embargo, no expresan esclerostina, el pro esclerostina, el producto del gen SOST que bloquea la formación ósea y es indispensable para la función de los osteocitos. Con el objetivo de aislar clones de las células MLO-Y4 con diferentes perfiles de expresión génica, realizamos cultivos a muy baja densidad de las células transfectadas en forma estable con proteína verde fluorescente nuclear (MLO-nGFP). La morfología celular fue evaluada utilizando un microscopio de fluorescencia. Una vez que las células alcanzaron el 80% de confluencia, el ARN fue extraído y analizado por PCR cuantitativa en tiempo real. Las células de los diferentes clones tienen diferentes tamaños y morfología, algunas células son fusiformes y otras con proyecciones citoplasmáticas abundantes y en forma de estrella. La expresión de los genes también varió en los distintos clones. Sin embargo, ninguno de ellos expresó SOST. En conclusión, los clones de las células MLO-nGFP constituyen una herramienta útil para estudiar la diferenciación de los osteocitos y el rol de estas células en el control de la formación y resorción ósea in vitro. (AU)
Assuntos
Humanos , Masculino , Feminino , Osteoblastos/citologia , Osteoclastos/citologia , Osteócitos/citologia , Linhagem Celular , Células Clonais/citologia , Osteoblastos/metabolismo , Osteoclastos/metabolismo , Osteócitos/metabolismo , Osteogênese/genética , Reabsorção Óssea/genética , Técnicas In Vitro , RNA/análise , Expressão Gênica , Reação em Cadeia da Polimerase , Colágeno/genética , Fosfatase Alcalina/metabolismo , Fluorescência , Antibacterianos/administração & dosagemRESUMO
Bisphosphonates (BPs) anti-fracture efficacy may be due in part to inhibition of osteocyte apoptosis. This effect requires opening of connexin (Cx) 43 hemichannels and phosphorylation of the extracellular signal regulated kinases (ERKs). However, unlike ERK activation by other stimuli, the Cx43/ERK pathway activated by BPs does not result in nuclear ERK accumulation. Instead, the anti-apoptotic effect of BPs depends on phosphorylation of cytoplasmic ERK targets and is abolished by forced nuclear retention of ERKs. We now report that ERKs and the scaffolding protein ß-arrestin co-immuno-precipitate with Cx43 in MLO-Y4 osteocytic cells and that the BP alendronate increases this association. Moreover, ERK2 fused to red fluorescent protein (ERK2-RFP) co-localizes with Cx43 fused to green fluorescent protein outside the nucleus in cells untreated or treated with alendronate. Alendronate does not induce ERK nuclear accumulation in cells transfected with wild type ß-arrestin (wtARR) or vector control, whereas it does in cells expressing a dominant negative ß-arrestin mutant (dnARR) consisting of the ß-arrestin-clathrin binding domain that competes with endogenous ß-arrestin for binding to clathrin. Alendronate activates ERKs in dnARRtransfected cells as effectively as in cells transfected with wtARR, demonstrating that dnARR only interferes with subcellular localization but not with activation of ERKs by BPs. Further, whereas alendronate inhibits apoptosis in cells expressing wtARR or vector control, it is ineffective in cells expressing dnARR. Thus, BPs induce the formation of a complex comprising Cx43, ß-arrestin, and clathrin, which directs ERKs outside the nucleus and is indispensable for osteocyte survival induced by BPs. (AU)
La efectividad de los bisfosfonatos (BPs) en la prevención de fracturas puede deberse en parte a la inhibición de la apoptosis de osteocitos. Este efecto depende de la apertura de hemicanales de conexina (Cx) 43 y la fosforilación de quinasas reguladas por señales extracelulares (ERKs). Sin embargo, a diferencia de la activación de ERKs debida a otros estímulos, la vía de señalización Cx43/ERK activada por BPs no conlleva la acumulación de ERKs en el núcleo. El efecto anti-apoptótico de los BPs depende de la fosforilación de blancos citoplasmáticos de ERKs y es inhibido cuando las quinasas son retenidas en el núcleo. En este estudio hemos demostrado que ERKs y la proteína "scaffolding" ß-arrestina co-inmunoprecipitan con Cx43 en células osteocíticas MLO-Y4 y que alendronato aumenta esta asociación. Más aún, ERK2 fusionada a la proteína roja fluorescente (ERK2-RFP) co-localiza con Cx43 fusionada con la proteína verde fluorescente fuera del núcleo en células tratadas con vehículo o alendronato. Alendronato no indujo la acumulación nuclear de ERK en células transfectadas con ß-arrestina nativa (wtARR) o con un vector control, pero si lo hizo en células que expresan una forma dominante negativa de ß-arrestina (dnARR), consistente en el dominio de interacción entre ß-arrestina y clatrina, y que compite con ß-arrestina endógena por la unión a clatrina. Alendronato activa ERKs con la misma eficiencia en células transfectadas con dnARR o wtARR, demostrando que dnARR sólo interfiere con la localización subcelular de ERKs, pero no con su activación inducida por los BPs. Más aún, mientras alendronato inhibe apoptosis en células que expresan wtARR o vector control, es inefectivo en células que expresan dnARR. En conclusión, los BPs inducen la formación de un complejo que incluye Cx43, ß-arrestina y clatrina, el cual retiene ERKs fuera del núcleo y es indispensable para la sobrevida de los osteocitos inducida por estas drogas. (AU)
Assuntos
Osteócitos/citologia , Núcleo Celular/enzimologia , Apoptose/efeitos dos fármacos , Conexina 43/metabolismo , MAP Quinases Reguladas por Sinal Extracelular/metabolismo , Difosfonatos/farmacologia , beta-Arrestinas/metabolismo , Osteócitos/efeitos dos fármacos , Osteócitos/metabolismo , Osso e Ossos/citologia , Sobrevivência Celular/efeitos dos fármacosRESUMO
Connexins are essential for the communication of cells among themselves and with their environment. Connexin hexamers assemble at the plasma membrane to form hemichannels that allow the exchange of cellular contents with the extracellular milieu. In addition, hemichannels expressed in neighboring cells align to form gap junction channels that mediate the exchange of contents among cells. Connexin 43 (Cx43) is the most abundant connexin expressed in bone cells and its deletion in all tissues leads to osteoblast dysfunction, as evidenced by reduced expression of osteoblast markers and delayed ossification. Moreover, Cx43 is essential for the survival of osteocytes; and mice lacking Cx43 in these cells exhibit increased prevalence of osteocyte apoptosis and empty lacunae in cortical bone. Work of several groups for the past few years has unveiled the role of Cx43 on the response of bone cells to a variety of stimuli. Thus, the preservation of the viability of osteoblasts and osteocytes by the anti-osteoporotic drugs bisphosphonates depends on Cx43 expression in vitro and in vivo. This survival effect does not require cell-to-cell communication and is mediated by unopposed hemichannels. Cx43 hemichannels are also required for the release of prostaglandins and ATP by osteocytes induced by mechanical stimulation in vitro. More recent evidence showed that the cAMP-mediated survival effect of parathyroid hormone (PTH) also requires Cx43 expression. Moreover, the hormone does not increase bone mineral content in mice haploinsufficient for Cx43 or lacking Cx43 in osteoblastic cells. Since inhibition of osteoblast apoptosis contributes, at least in part, to bone anabolism by PTH, the lack of response to the hormone might be due to the requirement of Cx43 for the effect of PTH on osteoblast survival. In summary, mounting evidence indicate that Cx43 is a key component of the intracellular machinery responsible for the transduction of signals in the skeleton in response to pharmacologic, hormonal and mechanical stimuli.
RESUMO
Los bifosfonatos son drogas ampliamente utilizadas para el tratamiento de patologías en las que hay un aumento en la fragilidad ósea. Estos agentes detienen la pérdida de hueso al inhibir la actividad de los osteoclastos, las células que resorben el hueso. Sin embargo, el modesto efecto de los bifosfonatos en el aumento en la masa ósea no explica completamente la disminución en la incidencia de fracturas observada en individuos tratados con estos agentes. Basados en la falta de correlación entre el aumento de la densidad mineral y la disminución en la incidencia de fracturas, hemos explorado la posibilidad de que parte del efecto beneficioso de los bifosfonatos se debe a la inhibición de la apoptosis de los osteocitos. Los osteocitos, osteoblastos diferenciados que se rodean de matriz ósea, constituyen la mayoría de las células que forman el hueso, y, a través de sus prolongaciones, forman una red que recorre el hueso. Debido a su posición en el hueso, los osteocitos constituyen las células ideales para percibir cambios mecánicos u hormonales e iniciar señales que llevan a la reparación del tejido, previniendo el deterioro del hueso y la posibilidad de fracturas. Los osteocitos se comunican entre sí y con las células en la superficie del hueso a través de canales de conexinas (Cx), especialmente Cx43. Nuestro grupo ha demostrado que los bifosfonatos, aún los que carecen de actividad anti-catabólica, previenen la apoptosis de osteocitos in vitro e in vivo. La protección de la viabilidad celular requiere la apertura de hemicanales de Cx43, pero es independiente de la activación de las uniones gap. La apertura de los hemicanales es seguida por la activación de la quinasas Src y ERKs.