RESUMO
The aim of this study was to monitor the progesterone and fecal estrone metabolites throughout gestation in ewes correlating with the serum levels of these steroid hormones. Therefore, fecal and serum samples were collected from 5 weeks before mating and gestation until two weeks postparturition. Serum levels of progesterone and estrone and their fecal metabolites were measured by enzyme immunoassay. Serum and fecal hormonal patterns showed a significant correlation for both hormones (R = 0.8572, P < 0.001 for progesterone and R = 0.5893, P < 0.001 for estrone). The fecal progesterone metabolite levels showed significant increasing values among the three thirds of pregnancies, consistent with the serum levels and with the literature. Additionally, the prepartum peak of estrone in the fecal matrix was identified but without observation in the serum matrix due to the blood collection interval used. Therefore, this study demonstrated the viability of progesterone and estrone monitoring throughout gestation using fecal samples, making noninvasive longitudinal endocrine monitoring throughout gestation possible in this species.(AU)
O objetivo deste estudo foi monitorar os níveis de metabólitos fecais de progesterona e estrona ao longo da gestação em ovelhas, correlacionando-os com os níveis séricos desses hormônios esteroides. Assim, amostras de fezes e sangue foram colhidas de cinco ovelhas no período pré-cobertura e durante a gestação, até duas semanas após o parto. Os níveis séricos de progesterona e estrona e de seus metabólitos fecais foram mensurados por enzimaimunoensaio. Os perfis hormonais séricos e fecais apresentaram correlação positiva significativa para os dois hormônios (R = 0,8572, P < 0,001 para progesterona e R = 0,5893, P < 0,001 para estrona). Os níveis de metabólitos fecais de progesterona apresentaram valores significativamente crescente entre os terços da gestação, corroborando com os níveis séricos e com os relatos da literatura. Adicionalmente, foi possível evidenciar o pico pré-parto de estrona na matriz fecal, porém sem registro na matriz sérica, provavelmente devido ao intervalo de coletas aplicado. Deste modo, este estudo demonstrou a viabilidade do monitoramento dos níveis de progesterona e estrona durante a gestação em ovinos utilizando amostras fecais, possibilitando monitoramento endócrino longitudinal não invasivo durante a gestação nessa espécie.(AU)
Assuntos
Animais , Feminino , Gravidez , Progesterona/análise , Estrona/análise , Ovinos/sangue , Esteroides/análise , FezesRESUMO
The aim of this study was to monitor the progesterone and fecal estrone metabolites throughout gestation in ewes correlating with the serum levels of these steroid hormones. Therefore, fecal and serum samples were collected from 5 weeks before mating and gestation until two weeks postparturition. Serum levels of progesterone and estrone and their fecal metabolites were measured by enzyme immunoassay. Serum and fecal hormonal patterns showed a significant correlation for both hormones (R = 0.8572, P < 0.001 for progesterone and R = 0.5893, P < 0.001 for estrone). The fecal progesterone metabolite levels showed significant increasing values among the three thirds of pregnancies, consistent with the serum levels and with the literature. Additionally, the prepartum peak of estrone in the fecal matrix was identified but without observation in the serum matrix due to the blood collection interval used. Therefore, this study demonstrated the viability of progesterone and estrone monitoring throughout gestation using fecal samples, making noninvasive longitudinal endocrine monitoring throughout gestation possible in this species.
O objetivo deste estudo foi monitorar os níveis de metabólitos fecais de progesterona e estrona ao longo da gestação em ovelhas, correlacionando-os com os níveis séricos desses hormônios esteroides. Assim, amostras de fezes e sangue foram colhidas de cinco ovelhas no período pré-cobertura e durante a gestação, até duas semanas após o parto. Os níveis séricos de progesterona e estrona e de seus metabólitos fecais foram mensurados por enzimaimunoensaio. Os perfis hormonais séricos e fecais apresentaram correlação positiva significativa para os dois hormônios (R = 0,8572, P < 0,001 para progesterona e R = 0,5893, P < 0,001 para estrona). Os níveis de metabólitos fecais de progesterona apresentaram valores significativamente crescente entre os terços da gestação, corroborando com os níveis séricos e com os relatos da literatura. Adicionalmente, foi possível evidenciar o pico pré-parto de estrona na matriz fecal, porém sem registro na matriz sérica, provavelmente devido ao intervalo de coletas aplicado. Deste modo, este estudo demonstrou a viabilidade do monitoramento dos níveis de progesterona e estrona durante a gestação em ovinos utilizando amostras fecais, possibilitando monitoramento endócrino longitudinal não invasivo durante a gestação nessa espécie.
Assuntos
Feminino , Animais , Gravidez , Esteroides/análise , Estrona/análise , Ovinos/sangue , Progesterona/análise , FezesRESUMO
Foram conduzidos dois experimentos para analisar a expressão de genes ligados ao desenvolvimento folicular e consequente eficiência reprodutiva em oócitos e células do cumulus em duas fases distintas da foliculogênese. Ovários de ovelhas de raças nativas abatidas no matadouro municipal de Caruaru/PE foram coletados e transportados para o Laboratório de Fisiologia Animal Molecular Aplicada (FAMA)/UFRPE. O primeiro grupo de amostras foi composto por oócitos e células do cumulus provenientes de folículos com tamanho entre 3,1 e 6 mm, classificados de acordo com os aspectos morfológicos como antrais. Os folículos foram puncionados/aspirados utilizando agulha e seringa (10 ml com agulha de 0,7 x 25 mm) e analisados em uma lupa (estereomicroscópio) para localização dos oócitos. Os oócitos que estavam rodeados pelas células do cumulus foram desnudados através de várias pipetagens e armazenados separadamente em tampão fosfato (PBS 1x). Nesta fase mais avançada do desenvolvimento folicular, foram coletados 100 oócitos distribuídos em pools de 10 células (n=10), e 10 amostras com pools de células do cumulus (n=10). Para colheita dos folículos menores que 3 mm, que formaram o segundo grupo de amostras, classificados morfologicamente como folículos pré-antrais (primários e secundários), os ovários foram fatiados com lâmina e o tecido mantido em tampão PBS 1x enquanto os oócitos eram separados e retirados do tecido ovariano. Os oócitos foram extraídos totalizando 10 amostras com pools de 10 células (n=10), além de 10 amostras com pools de células do cumulus (n=10) para esta fase inicial do desenvolvimento folicular. O RNA foi extraído dos oócitos e das células do cumulus e o cDNA foi obtido pela técnica de RT-PCR, utilizando Oligo DT randômico para o mRNA. No primeiro estudo, a análise da expressão foi realizada pela técnica de qPCR (PCR real time), confirmando expressão gênica para BMP15 nos oócitos, mas não em células do cumulus. Houve um aumento da expressão relativa do mRNA da BMP15 durante a fase mais tardia do desenvolvimento folicular e as diferenças foram consideradas significantes (p < 0,05). No segundo estudo, objetivou-se analisar a expressão do gene IGF-2, através de PCR em tempo real, nos dois grupos de oócitos e células do cumulus de acordo com a fase folicular. A análise da expressão confirmou a expressão gênica para IGF-2 nos grupos de oócitos e células do cumulus. Houve um aumento da expressão relativa do mRNA para IGF-2 nos grupos de oócitos durante a fase mais tardia do desenvolvimento folicular e as diferenças foram consideradas significantes (p < 0,05). Não houve variação significante da expressão de IGF2 entre os grupos de células do cumulus. Conclui-se que os fatores BMP-15 e IGF-2 têm níveis mais elevados de expressão em oócitos ovinos na segunda fase do desenvolvimento folicular nas condições adotadas. Porém, em células do cumulus, não houve expressão de BMP-15, mas IGF-2 apresentou semelhante perfil durante as fases estudadas do desenvolvimento folicular.
Two experiments were conducted to analyze the expression of genes related to follicular development and subsequent reproductive efficiency in oocytes and cumulus cells in two distinct phases of folliculogenesis. Ovaries of native breeds of sheep slaughtered in the abattoir in Caruaru/PE were collected and transported to the Laboratory of Applied Molecular Animal Physiology (FAMA)/UFRPE. The first group of samples was composed of cumulus cells and oocytes from follicles in size between 3.1 and 6 mm, classified morphologically as antral follicles. The follicles were simply punctured/aspirated using a needle and syringe (10 ml with needle 0.7 x 25 mm) and analyzed using a magnifier stereomicroscope for localization of the oocytes. The oocytes which were surrounded by cumulus cells were denuded using multiple pipetting and stored separately in phosphate buffer (PBS 1x). In this advanced stage of follicular development, oocytes were collected and distributed in "pools" of 10 cells (n = 10), and 10 samples with "pools" of cumulus cells (n = 10). For collection of follicles smaller than 3 mm, that formed the second group of samples, morphologically classified as preantral follicles (primary and secondary), the ovaries were sliced with a blade and the tissue kept in PBS 1x while the oocytes were separated and removed from the ovarian tissue using a magnifier. Oocytes were grouped in 10 samples with "pools" of 10 cells (n = 10), and 10 samples with "pools" of cumulus cells (n = 10) for this initial phase of follicular development. RNA was extracted from the oocytes and the cumulus cells and the cDNA was obtained by RT-PCR using random oligo dT to the mRNA. In the first study, the expression analysis was performed by qPCR (real time PCR) for BMP15 gene expression. Oocytes, but not cumulus cells, showed amplification for BMP15, and there was an increase in the relative expression of BMP15 mRNA during the later stage of follicular development and differences were considered significant (p <0.05). In the second study aimed to analyze the expression of IGF-II gene by PCR in real time in both groups of oocytes and cumulus cells according to the follicular phase. The expression analysis confirmed the expression of IGF-2 gene for groups of oocyte and the cumulus cells. There was an increase in the relative expression of mRNA for IGF-2 for groups of oocytes during the later stage of follicular development and differences were considered significant (p <0.05). There was no significant variation in the expression of IGF2 between groups of cumulus cells. It follows that the BMP-15 and IGF-2 have higher levels of expression in sheep oocytes in the second stage of follicular development in the conditions adopted. However, BMP-15 was not expressed in cumulus cells, but IGF-2 presented the same pattern during the stages of follicular development studied.