RESUMO
Present study aimed for detection, purification, quantification of Sind Krait (Bungarus sindanus) antivenom from chicken eggs and to determine extracted antivenom efficacy in mice. Hens' three groups were immunized by sub-lethal doses of Sind Krait venom with adjuvant paraffin oil+lecithin. Booster doses were injected subcutaneously on pectorals muscles at multiple sites after every two weeks upto eight weeks. Antibodies-IgY produced against Sind Krait venom was purified form eggs' yolk by precipitation method with PEG-6000. Purified antivenom-IgY protein contents were quantified by Nanodrop-photometer, purity accessed by SDS-PAGE, specificity checked by Ochterloneys method and titer estimated by indirect ELISA. Antivenom efficacy was assessed in albino mice. Purified antivnom-IgY exhibited single protein band 180-190 kDa on SDS-PAGE under non-reduced condition and two-bands 63 - 65 kDa and 22 - 25 kDa correspondingly under-reduced condition. Immunodiffusion exhibited sharp precipitation lines of immune-complex (venom and extracted-IgY). In all groups (G1, G2 and G3) antivenom level sharply increase from 3rd to 4th week and maintained thereafter. G2 and G3 presented high titer upto 1:2048 dilutions, while G1 showed upto 1:1024 dilutions, as tested by indirect ELISA. In neutralization assay ED50 dose of G2 and G3 obtained antivenom was 400.23 µg/mice for more than twofold LD50 dose of venom and 100% protection was at 508.84 µg/mice that completely neutralized highly lethal dose of venom. But G1 ED50 was 405.66 µg/mice and provides 100% protection at 554.21 µg/mice. Extracted antivenom, against Sind Krait venom were highly pure, and with high neutralization capacity were produced successfully from eggs yolk first time in Pakistan.
O presente estudo teve como objetivo a detecção, purificação, quantificação do soro antiofídico em ovos de galinha e determinar a eficácia do soro antiofídico extraído em camundongos. Os três grupos de galinhas foram imunizados por doses subletais de veneno de cobra Sindhi krait com óleo de parafina adjuvante + lecitina. As doses de reforço foram injetadas por via subcutânea nos músculos do peito em vários locais após cada duas semanas até oito semanas. Anticorpos-IgY produzidos contra o veneno de Krait foram purificados da gema de ovo pelo método de precipitação com PEG-6000. Os conteúdos de proteína antiveneno-IgY purificada foram quantificados por fotômetro nanodrop enquanto a pureza foi acessada por SDS-PAGE. A especificidade do antiveneno-IgY foi verificada pelo método de Ochterloneys e o título foi estimado por ELISA indireto. A eficácia do antiveneno foi avaliada em camundongos albinos. A IgY purificada exibiu uma única banda de proteína 180-190 KDa em SDS-PAGE sob condição não reduzida e duas bandas 63 - 65 KDa e 22 - 25 KDa correspondentemente condição sub-reduzida. A imunodifusão exibiu linhas de precipitação nítidas de imunocomplexo (veneno e IgY extraída). Em todos os grupos (G1, G2 e G3) o nível do soro aumentou acentuadamente da 3ª para a 4ª semana e manteve-se a partir daí. G2 e G3 apresentaram títulos elevados até diluições de 1:2048, enquanto G1 apresentou diluições de até 1:1024, testado por ELISA indireto. No ensaio de neutralização, a dose ED50 de antiveneno G2 e G3 obtida foi de 400,23ug/camundongos para mais de duas vezes a LD50 e 100% de proteção foi @ 508,84ug/camundongos que neutralizam completamente a dose altamente letal de veneno. Mas G1 ED50 foi de 405,66ug/camundongos e forneceu 100% de proteção @ 554,21ug/camundongos. Antivenenos extraídos, contra veneno de Bungarus sindanus eram altamente puros, seu título de anticorpos e capacidade de neutralização foram produzidos com sucesso a partir de gemas de ovos de galinhas imunizadas pela primeira vez no Paquistão.
Assuntos
Animais , Imunoglobulinas , Imunoensaio/veterinária , Galinhas , Bungarus , Venenos ElapídicosRESUMO
Avian-derived IgY is thought to be the best therapy for scorpion bites concerning low-level side effects. The present study analyzed a hypothesis about the neutralization of scorpion venom Androcotonus australis through antibodies produced in the egg yolks of chickens. The venom used for inoculation was obtained from Androctonus australis (yellow fat-tailed scorpion) from southern Punjab, Pakistan. The lethal dose of LD50 against scorpion venom was calculated in chickens and mice. Safe doses were given to egg-laying chickens to produce IgY antibodies. The antivenom IgY antibodies were extracted from the egg yolks of immunized chicken using the polyethylene glycol (PEG) method. Moreover, IgY was confirmed through sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and the Ouchterlony double immunodiffusion assay test. The antibody titers were evaluated by the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The neutralisation capacity of extracted anti-scorpion antibodies was tested on mice. The calculated LD50 of scorpion venom for chicken and mice was 4 mg/kg and 2.5 mg/kg, respectively. SDS-PAGE and Ouchterlony double immunodiffusion confirmed the presence of IgY against scorpion venom. The maximum titer value of specific IgY produced against scorpion venom was 3.5 ug/ml. A concentration of 220 ul/LD50 was effective to neutralize 1 mg of scorpion venom. It is suggested that IgY obtained from egg yolks is safe against targeted venom and can be used as an effective alternative to equine IgG antibodies against scorpion envenoming.
Acredita-se que a IgY derivada de aves seja a melhor terapia para picadas de escorpião em relação aos efeitos colaterais. O presente estudo teve como objetivo analisar uma hipótese sobre a neutralização do veneno do escorpião Androcotonus australis através de anticorpos produzidos na gema de ovos de galinhas. O veneno usado para inoculação foi obtido de Androctonus australis (escorpião amarelo de cauda gorda) do sul de Punjab, Paquistão. A dose letal de LD50 contra veneno de escorpião foi calculada em galinhas e camundongos. Doses seguras foram dadas a galinhas poedeiras para produzir anticorpos IgY. Os anticorpos antiveneno IgY foram extraídos das gemas de ovos de galinhas imunizadas pelo método do polietilenoglicol (PEG). Além disso, a IgY foi confirmada por eletroforese em gel de poliacrilamida e dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE) e pelo teste de imunodifusão dupla de Ouchterlony. Os títulos de anticorpos foram avaliados pelo ensaio imunoenzimático (ELISA). A capacidade de neutralização dos anticorpos anti-escorpião extraídos foi testada em camundongos. A LD50 calculada do veneno de escorpião para galinhas e camundongos foi de 4 mg/kg e 2,5 mg/kg, respectivamente. SDS-PAGE e imunodifusão dupla Ouchterlony confirmaram a presença de IgY contra veneno de escorpião. O valor máximo do título de IgY específico produzido contra veneno de escorpião foi de 3,5 ug/ml. Uma concentração de 220 ul/LD50 foi considerada eficaz para neutralizar 1 mg de veneno de escorpião. Sugere-se que a IgY obtida da gema do ovo seja segura contra o veneno direcionado e possa ser usada como uma alternativa eficaz aos anticorpos IgG equinos contra o envenenamento por escorpiões.