RESUMO
Oxidative damage is involved in triggering neuronal death in several retinal neurodegenerative diseases. The recent finding of stem cells in the retina suggests that both preventing neuronal death and replacing lost neurons might be useful strategies for treating these diseases. We have previously shown that oxidative stress induces apoptosis in cultured retinal neurons. We now investigated the response of Müller cells, proposed as retina stem cells, to this damage. Treatment of glial cell cultures prepared from rat retinas with the oxidant paraquat (PQ) did not induce glial cell apoptosis. Instead, PQ promoted their rapid dedifferentiation and proliferation. PQ decreased expression of a marker of differentiated glial cells, simultaneously increasing the expression of smooth muscle actin, shown to increase with glial dedifferentiation, the levels of cell-cycle markers, and the number of glial cells in the cultures. In addition, glial cells protected neurons in coculture from apoptosis induced by PQ and H(2)O(2). In pure neuronal cultures, PQ induced apoptosis of photoreceptors and amacrine neurons, simultaneously decreasing the percentage of neurons preserving mitochondrial membrane potential; coculturing neurons with glial cells completely prevented PQ-induced apoptosis and preserved mitochondrial potential in both neuronal types. These results demonstrate that oxidative damage activated different responses in Müller glial cells; they rapidly dedifferentiated and enhanced their proliferation, concurrently preventing neuronal apoptosis. Glial cells might not only preserve neuronal survival but also activate their cell cycle in order to provide a pool of new progenitor cells that might eventually be manipulated to preserve retinal functionality.
Assuntos
Desdiferenciação Celular , Proliferação de Células , Neuroglia/fisiologia , Estresse Oxidativo/fisiologia , Retina/citologia , Neurônios Retinianos/citologia , Actinas/metabolismo , Animais , Apoptose/efeitos dos fármacos , Desdiferenciação Celular/efeitos dos fármacos , Proliferação de Células/efeitos dos fármacos , Células Cultivadas , Técnicas de Cocultura , Peróxido de Hidrogênio/farmacologia , Potencial da Membrana Mitocondrial , Neuroglia/citologia , Neuroglia/efeitos dos fármacos , Oxidantes/farmacologia , Paraquat/farmacologia , Ratos , Ratos Wistar , Retina/efeitos dos fármacos , Neurônios Retinianos/fisiologiaRESUMO
The finding that Müller cells have stem cell properties in the retina has led to the hypothesis that they might be a source for replacing neurons lost in neurodegenerative diseases. However, utilization of Müller cells for regenerative purposes in the mammalian eye still requires identifying those factors that regulate their multipotentiality and proliferation. In addition, because Pax6 expression is indispensable for eye development, its regulation would be required during regeneration. In the present study we investigated the regulation of cell-cycle progression and Pax6 expression in pure Müller glial cell cultures and neuroglial cocultures from rat retinas. At early times in vitro, glial cells showed high expression of Pax6 and of nestin, a stem cell marker, and of markers of cell-cycle progression; expression of these markers decreased during development in parallel with increased glial differentiation. The addition of glial-derived neurotrophic factor, basic fibroblast growth factor, and insulin restored proliferation and also Pax6 and nestin expression in glial cells. Noteworthy, in neuroglial cocultures Müller cells retained Pax6 expression for longer periods, and, in turn, neuronal progenitors preserved their proliferative potential for several days in vitro. This suggests that neuroglial interactions mutually regulate their mitogenic capacity. In addition, in glial secondary cultures incubated with insulin, many neuroblast-like cells expressed the neuronal marker NeuN. Our results suggest that the proliferative capacity and the features of eye stem cells of Müller glial cells are regulated by molecular and cellular factors, which might then provide potential tools for manipulating retinal regeneration.
Assuntos
Ciclo Celular/fisiologia , Proteínas do Olho/metabolismo , Expressão Gênica/fisiologia , Proteínas de Homeodomínio/metabolismo , Fatores de Crescimento Neural/metabolismo , Neuroglia/metabolismo , Neurônios/fisiologia , Fatores de Transcrição Box Pareados/metabolismo , Proteínas Repressoras/metabolismo , Células-Tronco/fisiologia , Albinismo , Animais , Animais Recém-Nascidos , Bromodesoxiuridina , Diferenciação Celular/efeitos dos fármacos , Diferenciação Celular/fisiologia , Proliferação de Células/efeitos dos fármacos , Sobrevivência Celular , Células Cultivadas , Técnicas de Cocultura/métodos , Proteínas do Olho/genética , Expressão Gênica/efeitos dos fármacos , Proteínas de Homeodomínio/genética , Marcação In Situ das Extremidades Cortadas/métodos , Fatores de Crescimento Neural/genética , Fatores de Crescimento Neural/farmacologia , Proteínas do Tecido Nervoso/metabolismo , Neurônios/metabolismo , Fator de Transcrição PAX6 , Fatores de Transcrição Box Pareados/genética , Ratos , Proteínas Repressoras/genética , Retina/citologia , Fatores de TempoRESUMO
PURPOSE: A recent study has shown that glia-derived neurotrophic factor (GDNF) and docosahexaenoic acid (DHA) promote the survival and differentiation of retina photoreceptors. The current study was undertaken to investigate whether these molecules participate in cell cycle regulation in retinal progenitors in vitro. METHODS: Developmental changes in the expression of the stem cell marker nestin and of cell cycle and differentiated neuron markers were analyzed in neuroblasts obtained from 1-day-old rat retinas. The effects of GDNF and DHA on those changes were then determined. RESULTS: Expression of nestin, found in more than one third of neuroblasts at day 1, rapidly decreased during development, with most neuroblasts acquiring the photoreceptor phenotype. GDNF increased the percentage of photoreceptor progenitors expressing nestin, whereas DHA reduced it, simultaneously enhancing photoreceptor differentiation. Several markers of cell cycle progression indicated that photoreceptor progenitors maintained an active cell cycle during the first 2 days in vitro. GDNF stimulated the cell cycle, increasing the number of dividing cells and generating more photoreceptor progenitors, whereas DHA induced cell cycle exit and photoreceptor differentiation. Analysis of the expression of the cyclin-Cdk inhibitor p27(Kip1) confirmed these results. CONCLUSIONS: GDNF and DHA acted as molecular cues, counterbalancing the decision of photoreceptors to remain in or exit the cell cycle. The results strongly suggest that both factors participate in determining the number of photoreceptors in vitro, regulating the cell cycle and survival at early and late stages of development, respectively. Hence, GDNF and DHA may coordinately control the histogenesis of photoreceptors in the retina by modulating both neurogenesis and apoptosis.
Assuntos
Ciclo Celular/efeitos dos fármacos , Ácidos Docosa-Hexaenoicos/farmacologia , Fatores de Crescimento Neural/farmacologia , Proteínas do Tecido Nervoso , Retina/citologia , Células-Tronco/citologia , Animais , Animais Recém-Nascidos , Proteínas de Ciclo Celular/metabolismo , Diferenciação Celular/efeitos dos fármacos , Sobrevivência Celular/efeitos dos fármacos , Inibidor de Quinase Dependente de Ciclina p27 , Regulação para Baixo , Técnica Indireta de Fluorescência para Anticorpo , Corantes Fluorescentes/metabolismo , Fator Neurotrófico Derivado de Linhagem de Célula Glial , Indóis/metabolismo , Proteínas de Filamentos Intermediários/metabolismo , Nestina , Neurônios/citologia , Neurônios/metabolismo , Ratos , Ratos Wistar , Retina/metabolismo , Opsinas de Bastonetes/metabolismo , Células-Tronco/metabolismo , Proteínas Supressoras de Tumor/metabolismoRESUMO
In this study we show that insulin-like growth factor (IGF)-I selectively promotes survival and differentiation of amacrine neurons. In cultures lacking this factor, an initial degeneration pathway, selectively affecting amacrine neurons, led to no lamellipodia development and little axon outgrowth. Cell lysis initially affected 50% of amacrine neurons; those remaining underwent apoptosis leading to the death of approximately 95% of them by day 10. Apoptosis was preceded by a marked increase in c-Jun expression. Addition of IGF-I or high concentrations (over 1 microM) of either insulin or IGF-II to the cultures prevented the degeneration of amacrine neurons, stimulated their neurite outgrowth, increased phospho-Akt expression and decreased c-Jun expression. The high insulin and IGF-II concentrations required to protect amacrine cells suggest that these neurons depend on IGF-I for their survival, IGF-II and insulin probably acting through IGF-I receptors to mimic IGF-I effects. Inhibition of phosphatidylinositol-3 kinase (PI 3-kinase) with wortmannin blocked insulin-mediated survival. Wortmannin addition had similar effects to IGF-I deprivation: it prevented neurite outgrowth, increased c-Jun expression and induced apoptosis. These results suggest that IGF-I is essential for the survival and differentiation of amacrine neurons, and activation of PI 3-kinase is involved in the intracellular signaling pathways mediating these effects.
Assuntos
Fator de Crescimento Insulin-Like I/metabolismo , Neurônios/metabolismo , Proteínas Serina-Treonina Quinases , Retina/metabolismo , Androstadienos/farmacologia , Animais , Diferenciação Celular/efeitos dos fármacos , Diferenciação Celular/fisiologia , Sobrevivência Celular/efeitos dos fármacos , Sobrevivência Celular/fisiologia , Células Cultivadas , Relação Dose-Resposta a Droga , Insulina/farmacologia , Antagonistas da Insulina/farmacologia , Fator de Crescimento Insulin-Like I/farmacologia , Fator de Crescimento Insulin-Like II/metabolismo , Fator de Crescimento Insulin-Like II/farmacologia , Neuritos/efeitos dos fármacos , Neurônios/citologia , Neurônios/efeitos dos fármacos , Fosfatidilinositol 3-Quinases/metabolismo , Fosforilação/efeitos dos fármacos , Proteínas Proto-Oncogênicas/metabolismo , Proteínas Proto-Oncogênicas c-akt , Proteínas Proto-Oncogênicas c-jun/biossíntese , Pseudópodes/efeitos dos fármacos , Ratos , Ratos Wistar , Retina/citologia , Retina/efeitos dos fármacos , WortmaninaRESUMO
La utilización de pruebas rápidas para la detección de anticuerpos anti-HIV suele ser necesaria de urgencia ante accidentes profesionales, o en laboratorios de baja complejidad. Nuestro objetivo fue evaluar esta prueba en comparación con un enzimoinmunoensayo de tercera generación (MEIA). Para ello se utilizó una prueba rápida (Determine HIV 1,2 Abbott), MEIA (HIV 1,2 Axsym, Abbott), Western Blot (WB Bio Rad), y carga viral (Amplicor Monitor, Roche Diagnostics). Se estudiaron 236 sueros MEIA reactivos y 125 MEIA no reactivos. Se titularon, además, 10 sueros con alto título. Determine presentó una sensibilidad del 100 por ciento, una especificidad del 97,3 por ciento y un valor predictivo positivo y negativo de 98,2 por ciento y del 100 por ciento, respecto de WB. Por otra parte, la sensibilidad y especificidad de MEIA respecto de WB fueron del 100 por ciento y 84,5 por ciento y sus valores predictivos positivos y negativos fueron del 90,3 por ciento y 100 por ciento, respectivamente. Los títulos de los 10 sueros obtenidos por MEIA fueron de 640 a 10.240 y los títulos obtenidos con Determine coincidieron en igual valor, o en un título menor. Determine mostró ser una alternativa válida desde el punto de vista de sensibilidad y especificidad para el tamizaje rápido de anti-HIV 1,2. (AU)
Assuntos
Humanos , Sorodiagnóstico da AIDS/métodos , Sorodiagnóstico da AIDS/estatística & dados numéricos , Acidentes de Trabalho/prevenção & controle , Técnicas Imunoenzimáticas , Carga Viral , Doença de Chagas/diagnósticoRESUMO
La utilización de pruebas rápidas para la detección de anticuerpos anti-HIV suele ser necesaria de urgencia ante accidentes profesionales, o en laboratorios de baja complejidad. Nuestro objetivo fue evaluar esta prueba en comparación con un enzimoinmunoensayo de tercera generación (MEIA). Para ello se utilizó una prueba rápida (Determine HIV 1,2 Abbott), MEIA (HIV 1,2 Axsym, Abbott), Western Blot (WB Bio Rad), y carga viral (Amplicor Monitor, Roche Diagnostics). Se estudiaron 236 sueros MEIA reactivos y 125 MEIA no reactivos. Se titularon, además, 10 sueros con alto título. Determine presentó una sensibilidad del 100 por ciento, una especificidad del 97,3 por ciento y un valor predictivo positivo y negativo de 98,2 por ciento y del 100 por ciento, respecto de WB. Por otra parte, la sensibilidad y especificidad de MEIA respecto de WB fueron del 100 por ciento y 84,5 por ciento y sus valores predictivos positivos y negativos fueron del 90,3 por ciento y 100 por ciento, respectivamente. Los títulos de los 10 sueros obtenidos por MEIA fueron de 640 a 10.240 y los títulos obtenidos con Determine coincidieron en igual valor, o en un título menor. Determine mostró ser una alternativa válida desde el punto de vista de sensibilidad y especificidad para el tamizaje rápido de anti-HIV 1,2.
Assuntos
Humanos , Acidentes de Trabalho/prevenção & controle , Técnicas Imunoenzimáticas , Sorodiagnóstico da AIDS/métodos , Sorodiagnóstico da AIDS , Doença de Chagas/diagnóstico , Carga ViralAssuntos
Humanos , Doença de Chagas/fisiopatologia , Doença de Chagas/epidemiologia , Doença de Chagas/diagnóstico , Trypanosoma cruzi/patogenicidade , Testes de Hemaglutinação/estatística & dados numéricos , Testes Sorológicos/métodos , Imunoensaio/métodos , Doadores de Sangue , Testes Obrigatórios/métodos , Valor Preditivo dos TestesRESUMO
En los enzimoinmunoensayos de segunda generación (EIA 2.0) se incrementó la sensibilidad y especificidad respecto de los de primera generación. Actualmente se emplean los equipos de tercera generación (EIA3.0) con el fin de acortar el período de ventana y mejorar el comportamiento de sus versiones anteriores. El objetivo de este trabajo es evaluar el comportamiento de EIA 3.0 y EIA 2.0 en la población de dadores de sangre (DS) de nuestro hospital y relacionarlos con un ensayo suplementario (LIA III), con especial énfasis en las distintas intensidades de reacción (RP) de ambos EIAs. Fueron estudiados 15.898 DS con reactivos Abbott HCV EIA 2.0 y 4.147 con Abbott HCV EIA 3.0 (Abbott Laboratoires, Wiesbaden, Alemania). Las muestras doblemente reactivas fueron evaluadas por InnoLIA III (Innogenetics, Bélgica). La prevalencia de DS seropositivos para HCV fue 1,17 por ciento por EIA 2.0 y 1,83 por ciento por EIA 3.0. Independientemente del valor de RP, el EIA 3.0 mostró una mayor frecuencia de muestras LIA III negativas e indeterminadas que el EIA 2.0 (negativas 44 por ciento versus 38 por ciento; indeterminadas 14 por ciento versus 4 por ciento). Este comportamiento fue similar en todos los valores de RP. Para DS EIA reactivos con RP>=4.0 el 100 por ciento fue LIA III positivo cuando se empleó EIA 2.0 y el 68 por ciento en los analizados con EIA 3.0. El perfil de bandas reactivas en LIA III fue similar para ambos equipos y se hace más completo e intenso al aumentar el RP. De estas observaciones se concluye que el EIA 3.0 posee una perfomance más pobre respecto de su versión anterior, con mayor porcentaje de resultados LIA III indeterminados y negativos, en casi todos los valores de RP. Esta elevada frecuencia de datos falso-positivos crea en el dador de sangre una preocupación innecesaria y hace necesario el empleo de pruebas suplementarias para su certificación, con el consiguiente incremento en el costo de la unidad de sangre estudiada y su posterior descarte. (AU)
Assuntos
Humanos , Técnicas Imunoenzimáticas/métodos , Anticorpos Anti-Hepatite C/sangue , Doadores de Sangue , Reações Antígeno-Anticorpo , Ensaio de Imunoadsorção Enzimática/métodos , Qualidade da ÁguaRESUMO
En los enzimoinmunoensayos de segunda generación (EIA 2.0) se incrementó la sensibilidad y especificidad respecto de los de primera generación. Actualmente se emplean los equipos de tercera generación (EIA3.0) con el fin de acortar el período de ventana y mejorar el comportamiento de sus versiones anteriores. El objetivo de este trabajo es evaluar el comportamiento de EIA 3.0 y EIA 2.0 en la población de dadores de sangre (DS) de nuestro hospital y relacionarlos con un ensayo suplementario (LIA III), con especial énfasis en las distintas intensidades de reacción (RP) de ambos EIAs. Fueron estudiados 15.898 DS con reactivos Abbott HCV EIA 2.0 y 4.147 con Abbott HCV EIA 3.0 (Abbott Laboratoires, Wiesbaden, Alemania). Las muestras doblemente reactivas fueron evaluadas por InnoLIA III (Innogenetics, Bélgica). La prevalencia de DS seropositivos para HCV fue 1,17 por ciento por EIA 2.0 y 1,83 por ciento por EIA 3.0. Independientemente del valor de RP, el EIA 3.0 mostró una mayor frecuencia de muestras LIA III negativas e indeterminadas que el EIA 2.0 (negativas 44 por ciento versus 38 por ciento; indeterminadas 14 por ciento versus 4 por ciento). Este comportamiento fue similar en todos los valores de RP. Para DS EIA reactivos con RP>=4.0 el 100 por ciento fue LIA III positivo cuando se empleó EIA 2.0 y el 68 por ciento en los analizados con EIA 3.0. El perfil de bandas reactivas en LIA III fue similar para ambos equipos y se hace más completo e intenso al aumentar el RP. De estas observaciones se concluye que el EIA 3.0 posee una perfomance más pobre respecto de su versión anterior, con mayor porcentaje de resultados LIA III indeterminados y negativos, en casi todos los valores de RP. Esta elevada frecuencia de datos falso-positivos crea en el dador de sangre una preocupación innecesaria y hace necesario el empleo de pruebas suplementarias para su certificación, con el consiguiente incremento en el costo de la unidad de sangre estudiada y su posterior descarte.