RESUMO
BACKGROUND: Novel developmental functions have been attributed to the P2X7 receptor (P2X7R) including proliferation stimulation and neural differentiation. Mouse embryonic stem cells (ESC), induced with retinoic acid to neural differentiation, closely assemble processes occurring during neuroectodermal development of the early embryo. PRINCIPAL FINDINGS: P2X7R expression together with the pluripotency marker Oct-4 was highest in undifferentiated ESC. In undifferentiated cells, the P2X7R agonist Bz-ATP accelerated cell cycle entry, which was blocked by the specific P2X7R inhibitor KN-62. ESC induced to neural differentiation with retinoic acid, reduced Oct-4 and P2X7R expression. P2X7R receptor-promoted intracellular calcium fluxes were obtained at lower Bz-ATP ligand concentrations in undifferentiated and in neural-differentiated cells compared to other studies. The presence of KN-62 led to increased number of cells expressing SSEA-1, Dcx and ß3-tubulin, as well as the number of SSEA-1 and ß3-tubulin-double-positive cells confirming that onset of neuroectodermal differentiation and neuronal fate determination depends on suppression of P2X7R activity. Moreover, an increase in the number of Ki-67 positive cells in conditions of P2X7R inhibition indicates rescue of progenitors into the cell cycle, augmenting the number of neuroblasts and consequently neurogenesis. CONCLUSIONS: In embryonic cells, P2X7R expression and activity is upregulated, maintaining proliferation, while upon induction to neural differentiation P2X7 receptor expression and activity needs to be suppressed.
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Diferenciação Celular , Proliferação de Células , Células-Tronco Embrionárias/metabolismo , Receptores Purinérgicos P2X7/fisiologia , Animais , Cálcio/metabolismo , Proteína Duplacortina , Células-Tronco Embrionárias/citologia , Técnicas de Inativação de Genes , Camundongos , Neurônios/citologia , Neurônios/metabolismo , Fator 3 de Transcrição de Octâmero/metabolismo , Receptores Purinérgicos P2X7/genética , Receptores Purinérgicos P2X7/metabolismo , Regulação para CimaRESUMO
Embryonic carcinoma cells are widely used models for studying the mechanisms of proliferation and differentiation occurring during early embryogenesis. We have now investigated how down-regulation of P2X2 and P2X7 receptor expression by RNA interference (RNAi) affects neural differentiation and phenotype specification of P19 embryonal carcinoma cells. Wild-type P19 embryonal carcinoma cells or cells stably expressing shRNAs targeting P2X2 or P2X7 receptor expression were induced to differentiate into neurons and glial cells in the presence of retinoic acid. Silencing of P2X2 receptor expression along differentiation promoted cell proliferation and an increase in the percentage of cells expressing glial-specific GFAP, while the presence of beta-3 tubulin-positive cells diminished at the same time. Proliferation induction in the presence of stable anti-P2X2 receptor RNAi points at a mechanism where glial proliferation is favored over growth arrest of progenitor cells which would allow neuronal maturation. Differently from the P2X2 receptor, inhibition of P2X7 receptor expression during neural differentiation of P19 cells resulted in a decrease in cell proliferation and GFAP expression, suggesting the need of functional P2X7 receptors for the progress of gliogenesis. The results obtained in this study indicate the importance of purinergic signaling for cell fate determination during neural differentiation, with P2X2 and P2X7 receptors promoting neurogenesis and gliogenesis, respectively. The shRNAs down-regulating P2X2 or P2X7 receptor gene expression, developed during this work, present useful tools for studying mechanisms of neural differentiation in other stem cell models.
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Células-Tronco de Carcinoma Embrionário/citologia , Células-Tronco Neurais/citologia , Neurogênese/fisiologia , Neuroglia/citologia , Neurônios/citologia , Receptores Purinérgicos P2X2/fisiologia , Receptores Purinérgicos P2X7/fisiologia , Tretinoína/fisiologia , Animais , Diferenciação Celular/genética , Células-Tronco de Carcinoma Embrionário/metabolismo , Células-Tronco de Carcinoma Embrionário/fisiologia , Camundongos , Células-Tronco Neurais/metabolismo , Células-Tronco Neurais/fisiologia , Neurogênese/genética , Neuroglia/metabolismo , Neuroglia/fisiologia , Neurônios/metabolismo , Neurônios/fisiologia , Interferência de RNA/fisiologia , Receptores Purinérgicos P2X2/genética , Receptores Purinérgicos P2X7/genética , Transdução de Sinais/genéticaRESUMO
Energy metabolism in the adult brain consumes large quantities of glucose, but little is known to date regarding how glucose metabolism changes during neuronal differentiation, a process that is highly demanding energetically. We studied changes in glucose metabolism during neuronal differentiation of P19 mouse embryonal carcinoma cells, E14Tg2A embryonic stem cells as well as during brain development of BLC57 mice. In all these models, we find that neurogenesis is accompanied by a shift from oxidative to fermentative glucose metabolism. This shift is accompanied by both a decrease in mitochondrial enzymatic activities and mitochondrial uncoupling. In keeping with this finding, we also observe that differentiation does not require oxidative metabolism, as indicated by experiments demonstrating that the process is preserved in cells treated with the ATP synthase inhibitor oligomycin. Overall, we provide evidence that neuronal differentiation involves a shift from oxidative to fermentative metabolism, and that oxidative phosphorylation is not essential for this process.
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Diferenciação Celular , Células-Tronco Embrionárias/metabolismo , Glucose/metabolismo , Neurônios/metabolismo , Animais , Encéfalo/embriologia , Encéfalo/metabolismo , Linhagem Celular Tumoral , Células-Tronco Embrionárias/citologia , Inibidores Enzimáticos/farmacologia , Camundongos , ATPases Mitocondriais Próton-Translocadoras/antagonistas & inibidores , ATPases Mitocondriais Próton-Translocadoras/metabolismo , Neurônios/citologia , Oligomicinas/farmacologia , Oxirredução/efeitos dos fármacos , Fosforilação Oxidativa/efeitos dos fármacosRESUMO
Muitos estudos demonstram que a abertura de canais de ´KPOT.+` mitocondriais sensíveis à ATP (mito´K ind.ATP`) previnem contra danos promovidos por isquemia/reperfusao em coração. Em geral, esta proteçao envolve mudanças no estado redox mitocondrial. Em cérebro, sabe-se que agonistas farmacológicos de mito´K ind.ATP` também protegem em modelo de isquemia/reperfusão. Entretanto, os mecanismos envolvidos na prevenção de danos em cérebro ainda não estão claros. 0 objetivo principal deste trabalho é compreender os efeitos de canais de K+ mitocondriais ATP-sensíveis em tecido cerebral e os mecanismos pelos quais a sua ativação pode proteger contra danos promovidos por excitotoxicidade, uma das principais consequências de um evento isquêmico em cerebro. Neste contexto, demonstramos a proteção pelo mito´K ind.ATP` em modelo de excitotoxicidade induzida pela ativação direta de receptores NMDA, utilizando cultura de células granulosas de cerebelo. Paralelamente a essa proteção, verificamos que a ativação de mito´K ind.ATP` reduz a geração de espécies reativas de oxigênio (ROS)...
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Ratos , Cérebro/metabolismo , Espécies Reativas de Oxigênio/metabolismo , Espécies Reativas de Oxigênio/toxicidade , Hipóxia-Isquemia Encefálica , Potássio/análise , Potássio/metabolismo , Proteínas Mitocondriais , Proteínas Mitocondriais/metabolismo , Sistema Nervoso Central/fisiologia , Espectrofotometria/métodos , Espectrofotometria , Meios de Cultura/análise , Sobrevivência Celular/genéticaRESUMO
Brain mitochondrial ATP-sensitive K+ channel (mitoK(ATP)) opening by diazoxide protects against ischemic damage and excitotoxic cell death. Here we studied the redox properties of brain mitoK(ATP) . MitoK(ATP) activation during excitotoxicity in cultured cerebellar granule neurons prevented the accumulation of reactive oxygen species (ROS) and cell death. Furthermore, mitoK(ATP) activation in isolated brain mitochondria significantly prevented H2O2 release by these organelles but did not change Ca2+ accumulation capacity. Interestingly, the activity of mitoK(ATP) was highly dependent on redox state. The thiol reductant mercaptopropionylglycine prevented mitoK(ATP) activity, whereas exogenous ROS activated the channel. In addition, the use of mitochondrial substrates that led to higher levels of endogenous mitochondrial ROS release closely correlated with enhanced K+ transport activity through mitoK(ATP). Altogether, our results indicate that brain mitoK(ATP) is a redox-sensitive channel that controls mitochondrial ROS release.
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Trifosfato de Adenosina/metabolismo , Cerebelo/citologia , Canais KATP/metabolismo , Mitocôndrias/enzimologia , Neurônios/ultraestrutura , Animais , Animais Recém-Nascidos , Cálcio/metabolismo , Células Cultivadas , Diazóxido/farmacologia , Interações Medicamentosas , Agonistas de Aminoácidos Excitatórios/toxicidade , Peróxido de Hidrogênio/metabolismo , L-Lactato Desidrogenase/metabolismo , Potencial da Membrana Mitocondrial/efeitos dos fármacos , Mitocôndrias/efeitos dos fármacos , Dilatação Mitocondrial/efeitos dos fármacos , Dilatação Mitocondrial/fisiologia , N-Metilaspartato/toxicidade , Neurônios/efeitos dos fármacos , Oxirredução , Oxigênio/metabolismo , Ratos , Espécies Reativas de Oxigênio/metabolismo , Tiopronina/farmacologiaRESUMO
Methylmalonic acidemia is an inherited metabolic disorder that leads to brain damage associated to the accumulation of methylmalonic acid (MMA) and impairment of energy metabolism. We demonstrate here that treatment with diazoxide, an agonist of mitochondrial ATP-sensitive K(+) channels (mitoK(ATP)), can prevent death promoted by treatment with MMA in PC12 cells and freshly prepared rat brain slices. This diazoxide effect was reversed by 5-hydroxydecanoate, a mitoK(ATP) antagonist, confirming it occurs due to the activity of this channel. Diazoxide was not capable of preventing inner membrane potential loss promoted by MMA and Ca(2+) in isolated mitochondria, indicating it does not directly prevent mitochondrial damage. Furthermore, diazoxide did not prevent respiratory inhibition in cells treated with MMA. Interestingly, we found that the mitochondrial inner membrane potential within intact cells treated with MMA was maintained in part by the reverse activity of ATP synthase (ATP hydrolysis) and that diazoxide prevented the formation of the membrane potential in the presence of MMA, in a manner sensitive to 5-hydroxydecanoate. Furthermore, the effects of diazoxide on cell survival after treatment with MMA were similar to those of ATP synthase inhibitor oligomycin and adenine nucleotide translocator inhibitor atractyloside. These results indicate that diazoxide prevents PC12 cell death promoted by MMA by decreasing mitochondrial ATP hydrolysis. These results uncover new potential neuroprotective effects of mitoK(ATP) agonists under situations in which oxidative phosphorylation is inhibited.
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Encéfalo/efeitos dos fármacos , Diazóxido/farmacologia , Ácido Metilmalônico/toxicidade , Neurônios/efeitos dos fármacos , Trifosfato de Adenosina/metabolismo , Animais , Atractilosídeo/farmacologia , Encéfalo/metabolismo , Encéfalo/patologia , Cálcio/metabolismo , Proliferação de Células/efeitos dos fármacos , Sobrevivência Celular/efeitos dos fármacos , Ácidos Decanoicos/farmacologia , Hidrólise/efeitos dos fármacos , Hidroxiácidos/farmacologia , Potenciais da Membrana/efeitos dos fármacos , Mitocôndrias/efeitos dos fármacos , Mitocôndrias/metabolismo , Mitocôndrias/fisiologia , Membranas Mitocondriais/efeitos dos fármacos , Membranas Mitocondriais/fisiologia , ATPases Mitocondriais Próton-Translocadoras/metabolismo , Neurônios/metabolismo , Neurônios/patologia , Células PC12 , Bloqueadores dos Canais de Potássio/farmacologia , Canais de Potássio/agonistas , Canais de Potássio/fisiologia , RatosRESUMO
Two distinct K+ uniporters have been described in mitochondria, ATP-sensitive and Ca2+-activated. Both are capable of protecting tissues against ischemia and other forms of injury when active. These findings indicate a central role for mitochondrial K+ uptake in tissue protection. This review describes the characteristics of mitochondrial K+ uniport, physiological consequences of this transport, forms of tissue damage in which K+ channels are implicated and possible mechanisms through which protection occurs.
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Citoproteção/fisiologia , Mitocôndrias/metabolismo , Canais de Potássio/metabolismo , Animais , Cálcio/metabolismo , Cálcio/farmacologia , Humanos , Transporte de Íons , Mitocôndrias/efeitos dos fármacos , Membranas Mitocondriais/metabolismoRESUMO
Objetivo: Esta pesquisa tem o objetivo de correlacionar os valores plasmáticos do fibrinogênio com o hábito de fumar. O fumo é reconhecido fator de risco para doenças átero-trombóticas; por isso, sua associação com taxas altas de fibrinogênio poderá aumentar a carga de risco para a doença. Métodos: Foram analisados 75 pacientes do sexo masculino com idade superior a 21 anos. Para a dosagem do fibrinogênio, foi urilizado o método de Goodwin. Esta glicoproteína foi precipitada com sulfato de amônio, este precipitado dissolvido com hidróxido de sódio a 10% e dosado pelo reagente de biureto. A leitura foi feita em espectrofotômetro a 530 nm. Resultados: A média dos valores do fibrinogênio em fumantes com acidentes cardiovasculares foi de 574 mg/dL e em fumantes sem acidentes, 560 mg/dL, sendo esta diferença não significante. Para os pacientes não-fumantes com acidentes foi 533 mg/dL e para não-fumantes sem acidentes, 349 mg/dL, sendo esta diferença muito significante. Conclusão: A taxa plasmática de fibrinogênio foi significantemente mais alta em fumantes que não-fumantes. Face ao seu potencial trombogênico, poderia aumentar a carga de risco quando associado a outros fatores para doenças átero-trombóticas