RESUMO
Cqm1 and Aam1 are α-glucosidases (EC 3.2.1.20) expressed in Culex quinquefasciatus and Aedes aegypti larvae midgut, respectively. These orthologs share high sequence similarity but while Cqm1 acts as a receptor for the Binary (Bin) insecticidal toxin from Lysinibacillus sphaericus, Aam1 does not bind the toxin, rendering Ae. aegypti refractory to this bacterium. Aam1 is heavily glycosylated, contrasting to Cqm1, but little is known regarding how glycosylation impacts on its function. This study aimed to compare the N-glycosylation patterns and the catalytic activities of Aam1 and Cqm1. Mutant proteins were generated where predicted Aam1 N-glycosylation sites (N-PGS) were either inserted into Cqm1 or abrogated in Aam1. The mutants validated four N-PGS which were found to localize externally on the Aam1 structure. These Aam1 and Cqm1 mutants maintained their Bin binding properties, confirming that glycosylation has no role in this interaction. The α-glucosidase activity of both proteins was next investigated, with Aam1 having a remarkably higher catalytic efficiency, influenced by changes in glycosylation. Molecular dynamics showed that glycosylated and nonglycosylated Aam1 models displayed distinct patterns that could influence their catalytic activity. Differential N-glycosylation may then be associated with higher catalytic efficiency in Aam1, enhancing the functional diversity of related orthologs.
Assuntos
Aedes/enzimologia , Culex/enzimologia , alfa-Glucosidases/metabolismo , Animais , Glicosilação , Bacilos Gram-Positivos , Simulação de Dinâmica MolecularRESUMO
The Binary (Bin) toxin from the entomopathogenic bacterium Lysinibacillus sphaericus acts on larvae of the culicid Culex quinquefasciatus through its binding to Cqm1, a midgut-bound α-glucosidase. Specific binding by the BinB subunit to the Cqm1 receptor is essential for toxicity however the toxin is unable to bind to the Cqm1 ortholog from the refractory species Aedes aegypti (Aam1). Here, to investigate the molecular basis for the interaction between Cqm1 and BinB, recombinant Cqm1 and Aam1 were first expressed as soluble forms in Sf9 cells. The two proteins were found to display the same glycosilation patterns and BinB binding properties as the native α-glucosidases. Chimeric constructs were then generated through the exchange of reciprocal fragments between the corresponding cqm1 and aam1 cDNAs. Subsequent expression and binding experiments defined a Cqm1 segment encompassing residues S129 and A312 as critical for the interaction with BinB. Through site directed mutagenesis experiments, replacing specific sets of residues from Cqm1 with those of Aam1, the 159GG160 doublet was required for this interaction. Molecular modeling mapped these residues to an exposed loop within the Cqm1's structure, compatible with a target site for BinB and providing a possible explanation for its lack of binding to Aam1.
Assuntos
Aedes/fisiologia , Toxinas Bacterianas/metabolismo , Culex/fisiologia , Proteínas de Insetos/genética , alfa-Glucosidases/metabolismo , Aedes/genética , Aedes/metabolismo , Animais , Bacillus , Toxinas Bacterianas/toxicidade , Culex/genética , Culex/metabolismo , Sistema Digestório/metabolismo , Proteínas de Insetos/metabolismo , Larva , Mutagênese Sítio-DirigidaRESUMO
A toxina Binária (Bin) é o principal fator tóxico da bactéria entomopatógena Lysinibacillus sphaericus e sua ação em Culex quinquefasciatus depende da ligação com receptores no intestino das larvas. Os receptores são as a-glicosidases Cqm1, localizadas no epitélio, ligadas por uma âncora de glicosil-fosfatidilinositol. Larvas de Aedes aegypti são refratárias à toxina, pois, não apresentam receptores funcionais, apesar de apresentarem um gene que codifica a proteína Aam1, com alta similaridade à Cqm1. Devido às lacunas a respeito do espectro de ação da toxina Bin, o objetivo deste estudo foi identificar epitopos de ligação da toxina no receptor Cqm1 e determinar a base molecular da sua ação para estas espécies de vetores. Os resultados obtidos a partir da análise comparativa das proteínas Cqm1 e Aam1 levaram à identificação de um epitopo da toxina Bin no receptor Cqm1, situado uma alça na região N-terminal S129-A312. Este epitopo é composto pelos aminoácidos 155PATGGG160, não conservados em Aam1 (158AETGKL163), e os resíduos 159GG160 são críticos para a ligação com a Bin...
The Bin toxin is the main toxic factor of the bacterium Lysinibacillus sphaericuswhose action in Culex quinquefasciatuslarvae depends on its binding to the midgut epithelial receptors...
Assuntos
Culex , Resistência a Inseticidas , Controle Biológico de Vetores , Receptores de Superfície Celular , Toxinas Bacterianas/toxicidadeRESUMO
Bin toxin from Bacillus sphaericus acts on Culex quinquefasciatus larvae by binding to Cqm1 midgut-bound receptors, and disruption of the cqm1 gene is the major cause of resistance. The goal of this work was to screen for a laboratory-selected resistance cqm1(REC) allele in field populations in the city of Recife, Brazil, and to describe other resistance-associated polymorphisms in the cqm1 gene. The cqm1(REC) allele was detected in the four nontreated populations surveyed at frequencies from 0.001 to 0.017, and sequence analysis from these samples revealed a novel resistant allele (cqm1(REC-D16)) displaying a 16-nucletotide (nt) deletion which is distinct from the 19-nt deletion associated with cqm1(REC). Yet a third resistant allele (cqm1(REC-D25)), displaying a 25-nt deletion, was identified in samples from a treated area exposed to B. sphaericus. A comparison of the three deletion events revealed that all are located within the same 208-nt region amplified during the screening procedure. They also introduce equivalent frameshifts in the sequence and generate the same premature stop codon, leading to putative transcripts encoding truncated proteins which are unable to locate to the midgut epithelium. The populations analyzed in this study contained a variety of alleles with mutations disrupting the function of the corresponding Bin toxin receptor. Their locations reveal a hot spot that can be exploited to assess the resistance risk through DNA screening.
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Bacillus/patogenicidade , Toxinas Bacterianas/toxicidade , Culex/genética , Proteínas de Insetos/genética , Mutação , Receptores de Superfície Celular/genética , Alelos , Animais , Brasil , Culex/imunologia , Culex/microbiologia , Polimorfismo GenéticoRESUMO
Aedes aegypti larvae are refractory to the insecticidal binary (Bin) toxin from Bacillus sphaericus, which is not able to bind to its target tissue in the larval midgut. In contrast, Culex pipiens larvae are highly susceptible to that toxin, which targets its midgut brush border membranes (BBMF) through the binding of the BinB subunit to specific receptors, the Cpm1/Cqm1 membrane-bound α-glucosidases. The identification of an Ae. aegypti gene encoding a Cpm1/Cqm1 orthologue, here named Aam1, led to the major goal of this study which was to investigate its expression. The aam1 transcript was found in larvae and adults from Ae. aegypti and a ≈73-kDa protein was recognized by an anti-Cqm1 antibody in midgut BBMF. The Aam1 protein displayed α-glucosidase activity and localized to the midgut epithelium, bound through a GPI anchor, similarly to Cpm1/Cqm1. However, no binding of native Aam1 was observed to the recombinant BinB subunit. Treatment of both proteins with endoglycosidase led to changes in the molecular weight of Aam1, but not Cqm1, implying that the former was glycosylated. The findings from this work rule out lack of receptors in larval stages, or its expression as soluble proteins, as a reason for Ae. aegypti refractoriness to Bin toxin.
Assuntos
Aedes/enzimologia , Toxinas Bacterianas/metabolismo , Expressão Gênica , Glicosilfosfatidilinositóis/metabolismo , Proteínas de Insetos/metabolismo , Inseticidas/metabolismo , alfa-Glucosidases/metabolismo , Aedes/genética , Aedes/crescimento & desenvolvimento , Aedes/metabolismo , Animais , Sistema Digestório/enzimologia , Sistema Digestório/metabolismo , Proteínas de Insetos/genética , Larva/enzimologia , Larva/genética , Larva/metabolismo , Dados de Sequência Molecular , Ligação Proteica , alfa-Glucosidases/genéticaRESUMO
O principal fator larvicida do Bacillus sphaericus (Bsp) para culicídeos é a protoxina Bin, produzida sob a forma de um cristal, durante a esporulação. Quando ingerido pelas larvas o cristal é processado e a toxina Bin reconhece e liga-se a receptores específicos do epitélio intestinal. O receptor em Culex quinquefasciatus é uma alfa-glicosidase de 60 kDa, ligada à membrana intestinal por uma âncora GPI, denominado Cqm1. Larvas de Aedes aegypti são consideradas refratárias ao Bsp, pois a toxina Bin não reconhece receptores no microvilli intestinal. No entanto, a análise do genoma do Ae. aegypti, revelou a presença do gene aam1, que codificaria uma proteína ortóloga e com 83 por cento de similaridade ao receptor Cqm1. O principal objetivo deste estudo foi elucidar a base molecular da refratariedade do Ae. aegypti ao Bsp, determinada pela ausência de ligação da toxina Bin ao epitélio intestinal das larvas. Para tal, foi feita uma investigação da expressão da proteína Aam1 e do perfil de alfa-glicosidases de Ae. aegypti, tendo como referência o receptor Cqm1. Os resultados mostraram que larvas e adultos de Ae. aegypti expressam uma alfa-glicosidase de membrana de 70 kDa, reconhecida pelo anticorpo anti-Cqm1, e que provavelmente trata-se da proteína Aam1. Tal proteína é expressa no microvilli intestinal das larvas em níveis superiores à Cqm1, no entanto, não apresenta capacidade de ligação à toxina Bin. Em uma segunda etapa, a avaliação de proteínas Aam1 e Cqm1 recombinantes, produzidas em lisado de reticulócitos de coelho, mostrou que ambas não foram capazes de se ligar específicamente à toxina Bin. A falha na ligação da proteína Cqm1 à toxina Bin pode ser decorrente da ausência do processamento pós-traducional adequado neste sistema de expressão, indicando que certas modificações podem ser críticas para a sua funcionalidade. O tratamento da proteína Cqm1 nativa à temperatura de 100 °C aboliu a sua capacidade de ligação à toxina Bin, indicando que a conformação da proteína pode ser essencial para a sua funcionalidade. Os resultados obtidos demonstram que, apesar dos altos níveis de expressão da Aam1 nas larvas de Ae. aegypti, a proteína não é capaz de ligar-se à toxina Bin. Tal fato estar relacionado a outros fatores críticos para sua funcionalidade, tais como diferenças conformacionais e/ou modificações pós-traducionais que determinem o status de refratariedade do Ae. aegypti