RESUMO
Doenças por prions são encefalopatias neurodegenerativas de origem infecciosa, esporádica ou hereditária que atingem tanto animais quanto o homem. Desde a identificação da isoforma celular da proteína prion e sequenciamento do gene que a codifica, diversas mutações têm sido descritas no gene PRNP, sendo que mais de 55 destas segregam com enfermidades. A partir da década de 90 foram relatadas diversas funções fisiológicas de PrPC e a hipótese de que as doenças de príon estão relacionadas à perda de função da proteína normal, e não apenas à neurotoxicidade da isoforma infecciosa, PrPSc, vem ganhando força desde então. Com o intuito de verificar a influência destas mutações na função fisiológica de PrPC, a interação da proteína com seus ligantes e sua distribuição celular, foram geradas moléculas de PrPC com as mutações V180I, T183A e E200K fusionadas a proteína fluorescente verde (GFPPrPC). Optamos por estudar estes mutantes uma vez que se localizam dentro sítio de interação entre PrPC e um de seus ligantes, a laminina, descrito por nosso grupo. Esta interação é fundamental para vários processos biológicos de células do sistema nervoso, como adesão e diferenciação celular. Dada a influência do polimorfismo no códon 129 no fenótipo de algumas doenças priônicas de origem genética, a alteração de aminoácido neste códon foi associada a cada mutação, gerando haplótipos 129M/180I, 129V/180I, 129M/183A, 129V/183A, 129M/200K e 129V/200K, além do tipo selvagem associado a 129M ou 129V. Através de microscopia confocal, mostramos que a GFP-PrPV180I e GFP-PrPE200K, assim como a proteína do tipo selvagem, estão distribuídas corretamente na célula Zanith da S. P. Cook ii (membrana plasmática e região perinuclear). Ao contrário, a mutação T183A afeta a distribuição celular da molécula de PrPC, independente do aminoácido presente no códon 129, resultando no acúmulo da proteína na região perinuclear, sugerindo retenção no retículo endoplasmático. Ainda, através da indução de internação da molécula de PrPC presente na superfície celular por adição de íons cobre ao meio de cultura, mostramos que as construções GFP-PrPV180I e GFP-PrPE200K são funcionais.Ensaios de migração celular utilizando laminina como substrato foram realizados a fim de avaliar funcionalmente os mutantes de PrPC. Para estes ensaios, as contruções foram transfectadas em células N2a, das quais selecionamos clones para obtenção de populações com níveis de expressão homogêneos. Não foi possível detectar diferença significativa na taxa de migração das células mutantes em relação às que expressam a proteína tipo-selvagem. No entanto, apenas com esta observação não podemos afirmar que as mutações não afetam a função normal da proteína. Assim, outras abordagens devem ser realizadas a fim de melhor avaliar o impacto destas mutações na função normal de PrPC.
Prion diseases are neurodegenerative encephalopathies that can have infectious, sporadic or inherited origin and affect both animals and humans. Since the identification of the cellular isoform of the prion protein, followed by the sequencing of its corresponding gene, several mutations have been described on the PRNP gene and more than 55 of those being related to pathologies. Over the years, many physiological functions of PrPC have been described, and the PrPC loss-of-function hypothesis, for the prion diseases, is getting more strength. In order to verify the influence of those mutations on the physiological functions of PrPC, we generated PrPC molecules containing the mutations V180I, T183A and E200K fused to green fluorescence protein (GFP). Those mutants were chosen because they are localized in the lamminin-PrPC binding site, which was previously described by our group. This interaction is required for various biological processes on the nervous system, including cell adhesion and differentiation. Interestingly, the polymorphism at codon 129 affects the phenotype of some prion diseases when associated with mutations, and need to be considered. Thus, PrPC molecules presenting a combination of the 129 polimorphism and the described mutations were generated resulting in the haplotypes: 129M/180I, 129V/180I, 129M/183A, 129V/183A, 129M/200K and 129V/200K, as well as wild-type with methionine or valine on codon 129. Using confocal microscopy, we showed that GFP-PrPV180I and GFP-PrPE200K, as well as the wild-type molecules, were correctly localized on the plasma membrane and perinuclear region. On the other hand, the mutation T183A altered the subcellular distribution of PrPC, independently of the amino acid present at Zanith da S. P. Cook iv codon 129, resulting in the protein accumulation at the perinuclear region, wich suggests PrPC retention in the endoplasmatic reticulum. Also, we showed that the GFP-PrPV180I and GFP-PrPE200K molecules are functional since they are internalized after the addition of copper ions to the culture medium. To evaluate the effect of the mutations on the PrPC function, we next performed migration assays using lamminin as the substrate. For that, the constructs were stably transfected in N2a cells, from which clones were selected to obtain homogeneous expression levels. No significative differences were detected on the migration rates of the mutants when comparing with their normal counterparts. However, with these preliminary observations is not possible to conclude that PrPC mutations do not affect the normal function of the protein. Further work, with different approaches, should be addressed for a better evaluation of the impact of these mutations on the normal functions of t he cellular prion protein.