RESUMO
Este estudo avaliou o limiar de detecção da técnica de PCR aliada à eletroforese capilar para diagnóstico da Brucella abortus em sêmen bovino. Doses inseminantes livres de patógenos foram contaminadas experimentalmente com B. abortus em escalas que variavam de 10(0) a 10(7) bactérias/mL e submetidas à extração de DNA pelo método de fenol/clorofórmio. A amplificação por PCR foi realizada utilizando-se oligonucleotídeos iniciadores, previamente descritos na literatura, BF-5'gcgctcaggctgccgacgcaa3' (cromóforo FAM) e BR-5'accagccattgcggtcggta3' para B. abortus.) Os pares de oligonucleotídeos geraram fragmentos de 193 pb. Após PCR, a visualização dos fragmentos foi realizada em gel de acrilamida 8% corada pela prata e por eletroforese capilar fluorescente em equipamento automático de análise de fragmentos de DNA. A detecção de DNA de B. abortus em sêmen bovino através de eletroforese capilar fluorescente foi possível a partir de concentração de 10(3) bactérias/mL, enquanto que em gel de poliacrilamida 8% o limite de detecção foi de 10(5) bactérias/mL. A eletroforese capilar demonstrou ser uma alternativa rápida, eficaz e de alta sensibilidade na detecção de DNA de Brucella em sêmen bovino, podendo ser uma valiosa ferramenta para a avaliação da sanidade do rebanho e para o controle de qualidade do sêmen produzido em centrais de inseminação artificial.
This study was performed in order to evaluate the detection limit of PCR with fluorescent capillary electrophoresis for Brucella abortus diagnosis in bovine semen. Negative bovine semen samples were artificially contaminated with B. abortus (10(0) to 10(7) bacteria/mL) and DNA was extracted by phenol/chloroform protocol. DNA was amplified by PCR with oligonucleotides previously described BF-5'gcgctcaggctgccgacgcaa3' (6-FAM labeled) and BR-5'accagccattgcggtcggta3' for B. abortus. Oligonucleotides generated DNA fragments of 193 bp. DNA fragments visualization was done under UV light at silver stained 8% poliacrylamide gel, and fluorescent capillary electrophoresis performed in an automatic DNA fragment analyzer. The detection limit of capillary electrophoresis for B. abortus was 10(3) bacteria/mL, while for silver stained 8% poliacrylamide gel it was 10(5) bacteria/mL. PCR with fluorescent capillary electrophoresis is fast, efficient and highly sensitive test for DNA detection of Brucella in bovine semen, and itcan be an important tool for health evaluation of the herd and semen sanitary control in artificial insemination centers.
Assuntos
Masculino , Animais , Bovinos , Análise do Sêmen/veterinária , Brucella/patogenicidade , Eletroforese Capilar/veterinária , Reação em Cadeia da Polimerase/veterináriaRESUMO
Este estudo avaliou o limiar de detecção da técnica de PCR aliada à eletroforese capilar para diagnóstico da Brucella abortus em sêmen bovino. Doses inseminantes livres de patógenos foram contaminadas experimentalmente com B. abortus em escalas que variavam de 10(0) a 10(7) bactérias/mL e submetidas à extração de DNA pelo método de fenol/clorofórmio. A amplificação por PCR foi realizada utilizando-se oligonucleotídeos iniciadores, previamente descritos na literatura, BF-5'gcgctcaggctgccgacgcaa3' (cromóforo FAM) e BR-5'accagccattgcggtcggta3' para B. abortus.) Os pares de oligonucleotídeos geraram fragmentos de 193 pb. Após PCR, a visualização dos fragmentos foi realizada em gel de acrilamida 8% corada pela prata e por eletroforese capilar fluorescente em equipamento automático de análise de fragmentos de DNA. A detecção de DNA de B. abortus em sêmen bovino através de eletroforese capilar fluorescente foi possível a partir de concentração de 10(3) bactérias/mL, enquanto que em gel de poliacrilamida 8% o limite de detecção foi de 10(5) bactérias/mL. A eletroforese capilar demonstrou ser uma alternativa rápida, eficaz e de alta sensibilidade na detecção de DNA de Brucella em sêmen bovino, podendo ser uma valiosa ferramenta para a avaliação da sanidade do rebanho e para o controle de qualidade do sêmen produzido em centrais de inseminação artificial.(AU)
This study was performed in order to evaluate the detection limit of PCR with fluorescent capillary electrophoresis for Brucella abortus diagnosis in bovine semen. Negative bovine semen samples were artificially contaminated with B. abortus (10(0) to 10(7) bacteria/mL) and DNA was extracted by phenol/chloroform protocol. DNA was amplified by PCR with oligonucleotides previously described BF-5'gcgctcaggctgccgacgcaa3' (6-FAM labeled) and BR-5'accagccattgcggtcggta3' for B. abortus. Oligonucleotides generated DNA fragments of 193 bp. DNA fragments visualization was done under UV light at silver stained 8% poliacrylamide gel, and fluorescent capillary electrophoresis performed in an automatic DNA fragment analyzer. The detection limit of capillary electrophoresis for B. abortus was 10(3) bacteria/mL, while for silver stained 8% poliacrylamide gel it was 10(5) bacteria/mL. PCR with fluorescent capillary electrophoresis is fast, efficient and highly sensitive test for DNA detection of Brucella in bovine semen, and itcan be an important tool for health evaluation of the herd and semen sanitary control in artificial insemination centers.(AU)
Assuntos
Animais , Masculino , Bovinos , Análise do Sêmen/veterinária , Brucella/patogenicidade , Reação em Cadeia da Polimerase/veterinária , Eletroforese Capilar/veterináriaRESUMO
O objetivo do presente estudo foi o de avaliar o efeito da somatotrofina bovina recombinante (BSTr) sobre a taxa de ovulaçäo após a induçäo, sobre o metabolismo intermediário do colesterol e da glicose em ovelhas, e no o ganho de peso de cordeiros lactentes cujas mäes foram tratadas com BSTr bem como as variaçöes do peso e escore corporal das mesmas. Utilizou-se para tanto 3mg/kg de BSTr em formulaçäo de liberaçäo prolongada em dose única para o primeiro experimento e, 4mg/kg para o segundo. No primeiro experimento, os resultados obtidos mostraram que a incidência de estro foi de 100 por cento nos grupos controle e tratado, onde o número de corpos lúteos encontrados foi de 0,9 ± 0,18 no grupo controle e 1,18 ± 0,12 no grupo tratado, näo sendo diferentes estatisticamente. Também näo houve diferenças entre os grupos quanto aos níveis de colesterol e glicose. No experimento 2, houve uma diminuiçäo na condiçäo corporal das ovelhas do grupo tratado entre os dias 1 e 10 e seu aumento entre os dias 10 e 20, (p<0,05). O peso dos cordeiros, das ovelhas e a variaçäo do escore corporal entre os dia 1 e 20 näo diferiram estatisticamente. Conclui-se que a somatotrofina bovina recombinante näo interfere na taxa de ovulaçäo em ovelhas, bem como no metabolismo intermediário do colesterol e da glicose destes animais. O seu uso afeta os escores corporais dos animais tratados alguns dias após o início do tratamento