RESUMO
A nucleoproteína (NP) do Vírus da Influenza Aviária (VIA) é um importante alvo antigênico no imunodiagnóstico desta doença, devido à sua baixa variabilidade entre as diferentes estirpes virais, resultando em uma elevada reatividade cruzada, e por ser também uma proteína altamente imunogênica para hospedeiros vertebrados. O objetivo deste estudo foi clonar parcialmente o gene codificador da NP do VIA e expressar em Escherichia coli como uma proteína recombinante fusionada ao polipeptídeo SUMO e uma etiqueta de poli-histidina, a fim de utilizá-la no desenvolvimento de um ensaio de ELISA indireto para a detecção de anticorpos específicos contra o VIA. O subtipo H4N6 do VIA tipo A foi propagado em ovos embrionados livres de patógenos e o RNA viral foi extraído. Após a Reação de Transcrição Reversa seguida pela Reação em Cadeia pela Polimerase (RT-PCR), foi obtido o material gênico a ser inserido no vetor pET SUMO (Invitrogen®) para posterior transformação em células de E. coli competentes. Foi realizada uma cinética da indução da expressão da NP recombinante (NPr), seguida da caracterização imunoquímica através das técnicas de PAGE-SDS e de Western Blotting, como também análise in silico dos principais sítios de antigenicidade. A NPr foi expressa na fração solúvel e facilmente purificada, sendo utilizada como uma preparação antigênica no ELISA indireto para detecção de anticorpos c
RESUMO
Em busca de adjuvantes de nova geração para uso na formulação de vacinas contra patógenos virais, o trabalho teve como objetivo preparar nanopartículas de quitosana para encapsular o VBI. Foi utilizado uma suspensão da estirpe H120 atenuada do VBI em líquido córion-alantóide (LCA) para a formulação das nanopartículas por meio da técnica de gelificação iônica. Foram testadas diferentes concentrações de quitosana, ácido acético e tripolifosfato de sódio (TPP) e em diferentes condições de pH. Para o preparo das nanopartículas, um volume da suspensão viral em LCA foi adicionado a 10 volumes da solução de quitosana previamente preparada e, a essa mistura depois de agitada, foram adicionados 5 volumes de TPP, deixando-se essa mistura sob agitação por mais 10 minutos. As nanopartículas foram separadas por duas centrifugações seguidas, sendo armazenado o sobrenadante enquanto que o precipitado, contendo as nanopartcículas foi ressuspendido em PBS. O tamanho das nanopartículas foi medido no aparelho Zetasizer e a eficiência do encapsulamento foi avaliada pela dosagem de proteína presente no sobrenandante através da técnica de Bradford e pela detecção do RNA genômico viral por RT-PCR. Os resultados demonstraram que as concentrações de quitosana e TPP e o pH influenciaram na geração das nanopartículas, sendo que a melhor formulação foi obtida com a quitosana a 0,2%, o TPP a 0,2% e em p
RESUMO
Em busca de adjuvantes de nova geração para uso na formulação de vacinas contra patógenos virais, o trabalho teve como objetivo preparar nanopartículas de quitosana para encapsular o VBI. Foi utilizado uma suspensão da estirpe H120 atenuada do VBI em líquido córion-alantóide (LCA) para a formulação das nanopartículas por meio da técnica de gelificação iônica. Foram testadas diferentes concentrações de quitosana, ácido acético e tripolifosfato de sódio (TPP) e em diferentes condições de pH. Para o preparo das nanopartículas, um volume da suspensão viral em LCA foi adicionado a 10 volumes da solução de quitosana previamente preparada e, a essa mistura depois de agitada, foram adicionados 5 volumes de TPP, deixando-se essa mistura sob agitação por mais 10 minutos. As nanopartículas foram separadas por duas centrifugações seguidas, sendo armazenado o sobrenadante enquanto que o precipitado, contendo as nanopartcículas foi ressuspendido em PBS. O tamanho das nanopartículas foi medido no aparelho Zetasizer e a eficiência do encapsulamento foi avaliada pela dosagem de proteína presente no sobrenandante através da técnica de Bradford e pela detecção do RNA genômico viral por RT-PCR. Os resultados demonstraram que as concentrações de quitosana e TPP e o pH influenciaram na geração das nanopartículas, sendo que a melhor formulação foi obtida com a quitosana a 0,2%, o TPP a 0,2% e em p
RESUMO
A nucleoproteína (NP) do Vírus da Influenza Aviária (VIA) é um importante alvo antigênico no imunodiagnóstico desta doença, devido à sua baixa variabilidade entre as diferentes estirpes virais, resultando em uma elevada reatividade cruzada, e por ser também uma proteína altamente imunogênica para hospedeiros vertebrados. O objetivo deste estudo foi clonar parcialmente o gene codificador da NP do VIA e expressar em Escherichia coli como uma proteína recombinante fusionada ao polipeptídeo SUMO e uma etiqueta de poli-histidina, a fim de utilizá-la no desenvolvimento de um ensaio de ELISA indireto para a detecção de anticorpos específicos contra o VIA. O subtipo H4N6 do VIA tipo A foi propagado em ovos embrionados livres de patógenos e o RNA viral foi extraído. Após a Reação de Transcrição Reversa seguida pela Reação em Cadeia pela Polimerase (RT-PCR), foi obtido o material gênico a ser inserido no vetor pET SUMO (Invitrogen®) para posterior transformação em células de E. coli competentes. Foi realizada uma cinética da indução da expressão da NP recombinante (NPr), seguida da caracterização imunoquímica através das técnicas de PAGE-SDS e de Western Blotting, como também análise in silico dos principais sítios de antigenicidade. A NPr foi expressa na fração solúvel e facilmente purificada, sendo utilizada como uma preparação antigênica no ELISA indireto para detecção de anticorpos c