RESUMO
ABSTRACT: Pseudorabies (PR) is a highly contagious viral disease of great animal health and economic importance in swine industry. The aim of this study was to evaluate different genomic regions, real-time PCR chemistries and equipment for the molecular diagnosis of PR. Eight primer pairs targeting four genes (gB, gC, gE, gD), three different qPCR chemistries (SybrGreen, hydrolysis probes and plexor) and two equipment (ABI7500, Rotorgene 3000) were evaluated. Oligonucleotides targeting gB using hydrolysis probes showed the best performance after evaluating efficiency (99%), the detection limit (10-1.5 TCID50 mL-1) and diagnostic sensitivity and; therefore, those primers were selected for performance verification factors such as repeatability, reproducibility and robustness (1.39% variance between days, 24% variance between analysts and 4.07% variance in analysis error). The qPCR standardized and validated in this research proved to be reliable for the diagnosis of PR and may be used in diagnostic laboratories that follow ISO 17025 and ISO 16140.
RESUMO: Pseudorraiva (PR) é uma doença viral altamente contagiosa de grande importância sanitária e econômica na indústria suína. O objetivo deste estudo foi avaliar diferentes regiões genômicas, químicas de PCR em tempo real e equipamentos para o diagnóstico molecular de PR. Foram avaliados quatro genes (GB, GC, GE, gD), três diferentes produtos químicos (SybrGreen, sondas de hidrólise e plexor) e dois equipamentos (ABI7500, Rotorgene 3000). Oligonucleotídeos com alvo para gB baseados na química de sondas de hidrólise apresentaram o melhor desempenho nos testes de eficiência (99%), de limite de detecção (10-1.5 TCID50 mL-1) e sensibilidade diagnóstica. Portanto, estes foram selecionados para fatores de verificação de desempenho, tais como a repetibilidade, reprodutibilidade e robustez (1,39% de variância entre dias, 24% variância entre analistas e 4,07% de variância por erro de análise). A qPCR, padronizada e validada neste trabalho, mostrou-se confiável para o diagnóstico de PR e pode ser utilizada em laboratórios de diagnóstico que se seguem normas internacionais como ISO 17025 e ISO 16140.
RESUMO
Porcine Respiratory Disease Complex (PRDC) is a group of diseases that cause high losses in the swine industry. Several infectious agents are related to PRDC including porcine circovirus 2 (PCV-2), pseudorabies virus (SuHV-1),Haemophilus parasuis (HP), Mycoplasma hypneumoniae (MH) and Pasteurela multocida (PM). The aim of this study was to develop real-time PCRs (qPCR) for the detection of these infectious agents. Oligonucleotides were designed for each specific infectious agent and labeled with different fluorophores to amplify specific parts of the genome. This was done in two groups of reactionsa duplex qPCR for SuHV-1 and PCV-2 and a multiplex qPCR to detect the three bacteria simultaneously. The reactions were tested in 142 pooled samples of swine lymph nodes and lungs with clinical signs of PRDC. There were 135 samples that tested positive for PCV-2, 61 for HP, 29 for PM, 30 for MH and zero for SuHV-1. We recorded 76 cases of co-infection. The qPCRs developed in this study are useful tools in the diagnosis of PRDC.
Complexo de Doenças Respiratórias de Suínos (CDRS ) é um grupo de doenças que causam grandes perdas na indústria suína. Vários agentes infecciosos estão relacionados com a CDRS , entre eles o circovírus suíno 2 (PCV -2), vírus da pseudo-raiva (SuHV -1) , Haemophilus parasuis (HP) ,Mycoplasma hypneumoniae (MH ) e Pasteurela multocida (PM). O objetivo com este estudo foi desenvolver PCR em tempo real (qPCR) para a detecção destes agentes infecciosos. Os oligonucleotídeos foram concebidos para cada agente infeccioso específico e marcado com fluoróforos diferentes para amplificar partes específicas do genoma em dois grupos de reacções , uma qPCR dúplex em SuHV -1 e PCV- 2 e uma qPCR multiplex para detectar as três bactérias simultaneamente. As reações foram testadas em 142 amostras de pools de linfonodos e pulmões de suínos com sinais clínicos de CDRS. Foram detectadas 135 amostras positivas para PCV- 2 , 61 para a HP, 29 para PM e 30 para MH e zero para SuHV -1, dentre esses foram registrados 76 casos de co-infecção . As qPCRs desenvolvidas neste estudo são ferramentas úteis no diagnóstico da CDRS.
RESUMO
Porcine Respiratory Disease Complex (PRDC) is a group of diseases that cause high losses in the swine industry. Several infectious agents are related to PRDC including porcine circovirus 2 (PCV-2), pseudorabies virus (SuHV-1),Haemophilus parasuis (HP), Mycoplasma hypneumoniae (MH) and Pasteurela multocida (PM). The aim of this study was to develop real-time PCRs (qPCR) for the detection of these infectious agents. Oligonucleotides were designed for each specific infectious agent and labeled with different fluorophores to amplify specific parts of the genome. This was done in two groups of reactionsa duplex qPCR for SuHV-1 and PCV-2 and a multiplex qPCR to detect the three bacteria simultaneously. The reactions were tested in 142 pooled samples of swine lymph nodes and lungs with clinical signs of PRDC. There were 135 samples that tested positive for PCV-2, 61 for HP, 29 for PM, 30 for MH and zero for SuHV-1. We recorded 76 cases of co-infection. The qPCRs developed in this study are useful tools in the diagnosis of PRDC.
Complexo de Doenças Respiratórias de Suínos (CDRS ) é um grupo de doenças que causam grandes perdas na indústria suína. Vários agentes infecciosos estão relacionados com a CDRS , entre eles o circovírus suíno 2 (PCV -2), vírus da pseudo-raiva (SuHV -1) , Haemophilus parasuis (HP) ,Mycoplasma hypneumoniae (MH ) e Pasteurela multocida (PM). O objetivo com este estudo foi desenvolver PCR em tempo real (qPCR) para a detecção destes agentes infecciosos. Os oligonucleotídeos foram concebidos para cada agente infeccioso específico e marcado com fluoróforos diferentes para amplificar partes específicas do genoma em dois grupos de reacções , uma qPCR dúplex em SuHV -1 e PCV- 2 e uma qPCR multiplex para detectar as três bactérias simultaneamente. As reações foram testadas em 142 amostras de pools de linfonodos e pulmões de suínos com sinais clínicos de CDRS. Foram detectadas 135 amostras positivas para PCV- 2 , 61 para a HP, 29 para PM e 30 para MH e zero para SuHV -1, dentre esses foram registrados 76 casos de co-infecção . As qPCRs desenvolvidas neste estudo são ferramentas úteis no diagnóstico da CDRS.
RESUMO
The goal of this research was to validate a Plexor® real time Polymerase Chain Reaction (qPCR) for Enzootic Bovine Leukosis (EBL) diagnosis by comparison with methods recommend by the World Animal Health Organization (OIE). The qPCR was compared with two other techniques: the nested PCR (nPCR) and to the agar gel immunodiffusion (AGID). Of 82 qPCR and nPCR analysed samples, 79 presented concordant results, being the concordance classified by Kappa Index as high. Between the PCRs and AGID, the number of concordant results was 71 and 69, out of 82, to qPCR and nPCR, respectively, being the concordance classified as considerable, in both cases. The qPCR presented high specificity and sensitivity values. The observed qPCR negative and positive predictive values show that the qPCR has a high capacity to correctly classify positive and negative results. The qPCR was not able to detect three positive animals and has a lightly higher cost than the nPCR. However, the qPCR its faster, less prone to contamination, has a high sensitivity and does not use or generate carcinogenic residues. We conclude that the qPCR may be used to replace the OIE nPCR technique in routine diagnosis in areas where EBL is endemic, as is the case of Brazil.
O objetivo deste trabalho foi realizar a validação de uma reação em cadeia da polimerase em tempo real com o sistema Plexor® (qPCR) para o diagnóstico da Leucose Enzoótica Bovina (LEB), por meio da comparação com testes de diagnóstico recomendados pela Organização Mundial de Saúde Animal (OIE). A qPCR foi comparada com duas outras técnicas: a PCR nested (nPCR) e a imunodifusão em gel de ágar (IDGA). Das 82 amostras analisadas pela qPCR e nPCR, 79 apresentaram resultados concordantes, sendo a concordância, classificada pelo Índice Kappa, como alta. Entre as PCRs e a IDGA, o número de resultados concordantes foi de 71 e 69, respectivamente, para qPCR e nPCR, sendo a concordância classificada como considerável. A qPCR apresentou altos valores de sensibilidade e especificidade. Os valores preditivos da qPCR observados demonstraram a alta capacidade de classificação dos casos positivos e negativos. A qPCR não foi capaz de detectar três amostras positivas e tem custo ligeiramente superior que a nPCR. Entretanto, a qPCR é uma técnica mais rápida, menos susceptível a contaminações, tem alta sensibilidade, não utiliza e não gera resíduos carcinogênicos. Concluímos que a qPCR pode substituir a nPCR recomendada pela OIE no diagnóstico de rotina em áreas em que a LEB é endêmica, como no Brasil.
RESUMO
The goal of this research was to validate a Plexor® real time Polymerase Chain Reaction (qPCR) for Enzootic Bovine Leukosis (EBL) diagnosis by comparison with methods recommend by the World Animal Health Organization (OIE). The qPCR was compared with two other techniques: the nested PCR (nPCR) and to the agar gel immunodiffusion (AGID). Of 82 qPCR and nPCR analysed samples, 79 presented concordant results, being the concordance classified by Kappa Index as high. Between the PCRs and AGID, the number of concordant results was 71 and 69, out of 82, to qPCR and nPCR, respectively, being the concordance classified as considerable, in both cases. The qPCR presented high specificity and sensitivity values. The observed qPCR negative and positive predictive values show that the qPCR has a high capacity to correctly classify positive and negative results. The qPCR was not able to detect three positive animals and has a lightly higher cost than the nPCR. However, the qPCR its faster, less prone to contamination, has a high sensitivity and does not use or generate carcinogenic residues. We conclude that the qPCR may be used to replace the OIE nPCR technique in routine diagnosis in areas where EBL is endemic, as is the case of Brazil.
O objetivo deste trabalho foi realizar a validação de uma reação em cadeia da polimerase em tempo real com o sistema Plexor® (qPCR) para o diagnóstico da Leucose Enzoótica Bovina (LEB), por meio da comparação com testes de diagnóstico recomendados pela Organização Mundial de Saúde Animal (OIE). A qPCR foi comparada com duas outras técnicas: a PCR nested (nPCR) e a imunodifusão em gel de ágar (IDGA). Das 82 amostras analisadas pela qPCR e nPCR, 79 apresentaram resultados concordantes, sendo a concordância, classificada pelo Índice Kappa, como alta. Entre as PCRs e a IDGA, o número de resultados concordantes foi de 71 e 69, respectivamente, para qPCR e nPCR, sendo a concordância classificada como considerável. A qPCR apresentou altos valores de sensibilidade e especificidade. Os valores preditivos da qPCR observados demonstraram a alta capacidade de classificação dos casos positivos e negativos. A qPCR não foi capaz de detectar três amostras positivas e tem custo ligeiramente superior que a nPCR. Entretanto, a qPCR é uma técnica mais rápida, menos susceptível a contaminações, tem alta sensibilidade, não utiliza e não gera resíduos carcinogênicos. Concluímos que a qPCR pode substituir a nPCR recomendada pela OIE no diagnóstico de rotina em áreas em que a LEB é endêmica, como no Brasil.
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The goal of this research was to validate a Plexor® real time Polymerase Chain Reaction (qPCR) for Enzootic Bovine Leukosis (EBL) diagnosis by comparison with methods recommend by the World Animal Health Organization (OIE). The qPCR was compared with two other techniques: the nested PCR (nPCR) and to the agar gel immunodiffusion (AGID). Of 82 qPCR and nPCR analysed samples, 79 presented concordant results, being the concordance classified by Kappa Index as high. Between the PCRs and AGID, the number of concordant results was 71 and 69, out of 82, to qPCR and nPCR, respectively, being the concordance classified as considerable, in both cases. The qPCR presented high specificity and sensitivity values. The observed qPCR negative and positive predictive values show that the qPCR has a high capacity to correctly classify positive and negative results. The qPCR was not able to detect three positive animals and has a lightly higher cost than the nPCR. However, the qPCR its faster, less prone to contamination, has a high sensitivity and does not use or generate carcinogenic residues. We conclude that the qPCR may be used to replace the OIE nPCR technique in routine diagnosis in areas where EBL is endemic, as is the case of Brazil.
O objetivo deste trabalho foi realizar a validação de uma reação em cadeia da polimerase em tempo real com o sistema Plexor® (qPCR) para o diagnóstico da Leucose Enzoótica Bovina (LEB), por meio da comparação com testes de diagnóstico recomendados pela Organização Mundial de Saúde Animal (OIE). A qPCR foi comparada com duas outras técnicas: a PCR nested (nPCR) e a imunodifusão em gel de ágar (IDGA). Das 82 amostras analisadas pela qPCR e nPCR, 79 apresentaram resultados concordantes, sendo a concordância, classificada pelo Índice Kappa, como alta. Entre as PCRs e a IDGA, o número de resultados concordantes foi de 71 e 69, respectivamente, para qPCR e nPCR, sendo a concordância classificada como considerável. A qPCR apresentou altos valores de sensibilidade e especificidade. Os valores preditivos da qPCR observados demonstraram a alta capacidade de classificação dos casos positivos e negativos. A qPCR não foi capaz de detectar três amostras positivas e tem custo ligeiramente superior que a nPCR. Entretanto, a qPCR é uma técnica mais rápida, menos susceptível a contaminações, tem alta sensibilidade, não utiliza e não gera resíduos carcinogênicos. Concluímos que a qPCR pode substituir a nPCR recomendada pela OIE no diagnóstico de rotina em áreas em que a LEB é endêmica, como no Brasil.
RESUMO
Pseudorabies is a disease caused by Suid herpesvirus 1 (PrV) and is responsible for considerable economic losses in the swine industry. The PrV has only one serotype, but based on RFLP (restriction fragment length polymorphism) the virus was divided into four genotypes named I, II, III, IV. The classical methods for PrV genotyping usually require virus isolation, DNA purification enzyme restriction analysis and a long electrophoresis. The aim of this research was to describe a faster and more sensitive method to detect and genotype PrV based on nested-PCR and restriction enzyme analysis. Twenty PrV isolates from south and southeast regions of Brazil, and the standard strain Shope were grown in PK-15 cells and submitted to PCR for glycoprotein E gene amplification. Additionally were tested 75 clinical samples (swine brain), with 25 positives for virus isolation and seroneutralization, and 50 negatives from a flock free PR with negative results in seroneutralization test. There was 100% of agreement between results of nested-PCR and virus isolation and seroneutralization and all samples detected were classified as genotype II. The nested-PCR, combined with restriction enzyme analysis, was able to detect and genotype PrV in 1-2 days with a sensitivity of 10-1,3 TCID50 mL-1. It was faster than classical methods described in the literature that require at least 7 days to be completed.
A pseudoraiva (PR) é uma enfermidade viral responsável por consideráveis perdas econômicas na indústria de suínos. O vírus da pseudoraiva (PrV) apresenta apenas um sorotipo, mas, por análise de restrição enzimática, foi classificado em quatro genótipos denominados I, II, III e IV. Os métodos usados para genotipagem dependem do isolamento do vírus, da purificação do DNA viral, da restrição enzimática do genoma completo e da visualização após eletroforese. O objetivo deste trabalho foi estabelecer um método mais rápido e sensível para detectar e genotipar o PrV por nested-PCR e análise de restrição enzimática. Vinte isolados do PrV das regiões Sul e Sudeste do Brasil e a estirpe padrão Shope foram replicadas em células PK-15 e submetidas à nested-PCR para o gene da glicoproteína E. Além desses vírus previamente isolados, foram avaliadas 75 amostras clínicas de cérebro de suíno em um total de 25 animais positivos para a PR no isolamento e na soroneutralização viral e 50 amostras negativas provenientes de animais negativos na soroneutralização viral e de granjas sem histórico de PR. Todas as amostras clínicas tiveram resultados compatíveis com o isolamento e a soroneutralização, e a totalidade das amostras positivas foi classificada como genótipo II. A sensibilidade analítica da nested-PCR foi de 10-1,3 TCID50 mL-1. A combinação da nested-PCR e da restrição enzimática foi capaz de detectar e genotipar o vírus com resultados em um a dois dias, sendo mais rápida que os métodos convencionais de restrição do genoma completo que podem demorar até sete dias.
RESUMO
Pseudorabies is a disease caused by Suid herpesvirus 1 (PrV) and is responsible for considerable economic losses in the swine industry. The PrV has only one serotype, but based on RFLP (restriction fragment length polymorphism) the virus was divided into four genotypes named I, II, III, IV. The classical methods for PrV genotyping usually require virus isolation, DNA purification enzyme restriction analysis and a long electrophoresis. The aim of this research was to describe a faster and more sensitive method to detect and genotype PrV based on nested-PCR and restriction enzyme analysis. Twenty PrV isolates from south and southeast regions of Brazil, and the standard strain Shope were grown in PK-15 cells and submitted to PCR for glycoprotein E gene amplification. Additionally were tested 75 clinical samples (swine brain), with 25 positives for virus isolation and seroneutralization, and 50 negatives from a flock free PR with negative results in seroneutralization test. There was 100% of agreement between results of nested-PCR and virus isolation and seroneutralization and all samples detected were classified as genotype II. The nested-PCR, combined with restriction enzyme analysis, was able to detect and genotype PrV in 1-2 days with a sensitivity of 10-1,3 TCID50 mL-1. It was faster than classical methods described in the literature that require at least 7 days to be completed.
A pseudoraiva (PR) é uma enfermidade viral responsável por consideráveis perdas econômicas na indústria de suínos. O vírus da pseudoraiva (PrV) apresenta apenas um sorotipo, mas, por análise de restrição enzimática, foi classificado em quatro genótipos denominados I, II, III e IV. Os métodos usados para genotipagem dependem do isolamento do vírus, da purificação do DNA viral, da restrição enzimática do genoma completo e da visualização após eletroforese. O objetivo deste trabalho foi estabelecer um método mais rápido e sensível para detectar e genotipar o PrV por nested-PCR e análise de restrição enzimática. Vinte isolados do PrV das regiões Sul e Sudeste do Brasil e a estirpe padrão Shope foram replicadas em células PK-15 e submetidas à nested-PCR para o gene da glicoproteína E. Além desses vírus previamente isolados, foram avaliadas 75 amostras clínicas de cérebro de suíno em um total de 25 animais positivos para a PR no isolamento e na soroneutralização viral e 50 amostras negativas provenientes de animais negativos na soroneutralização viral e de granjas sem histórico de PR. Todas as amostras clínicas tiveram resultados compatíveis com o isolamento e a soroneutralização, e a totalidade das amostras positivas foi classificada como genótipo II. A sensibilidade analítica da nested-PCR foi de 10-1,3 TCID50 mL-1. A combinação da nested-PCR e da restrição enzimática foi capaz de detectar e genotipar o vírus com resultados em um a dois dias, sendo mais rápida que os métodos convencionais de restrição do genoma completo que podem demorar até sete dias.
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Pseudorabies is a disease caused by Suid herpesvirus 1 (PrV) and is responsible for considerable economic losses in the swine industry. The PrV has only one serotype, but based on RFLP (restriction fragment length polymorphism) the virus was divided into four genotypes named I, II, III, IV. The classical methods for PrV genotyping usually require virus isolation, DNA purification enzyme restriction analysis and a long electrophoresis. The aim of this research was to describe a faster and more sensitive method to detect and genotype PrV based on nested-PCR and restriction enzyme analysis. Twenty PrV isolates from south and southeast regions of Brazil, and the standard strain Shope were grown in PK-15 cells and submitted to PCR for glycoprotein E gene amplification. Additionally were tested 75 clinical samples (swine brain), with 25 positives for virus isolation and seroneutralization, and 50 negatives from a flock free PR with negative results in seroneutralization test. There was 100% of agreement between results of nested-PCR and virus isolation and seroneutralization and all samples detected were classified as genotype II. The nested-PCR, combined with restriction enzyme analysis, was able to detect and genotype PrV in 1-2 days with a sensitivity of 10-1,3 TCID50 mL-1. It was faster than classical methods described in the literature that require at least 7 days to be completed.
A pseudoraiva (PR) é uma enfermidade viral responsável por consideráveis perdas econômicas na indústria de suínos. O vírus da pseudoraiva (PrV) apresenta apenas um sorotipo, mas, por análise de restrição enzimática, foi classificado em quatro genótipos denominados I, II, III e IV. Os métodos usados para genotipagem dependem do isolamento do vírus, da purificação do DNA viral, da restrição enzimática do genoma completo e da visualização após eletroforese. O objetivo deste trabalho foi estabelecer um método mais rápido e sensível para detectar e genotipar o PrV por nested-PCR e análise de restrição enzimática. Vinte isolados do PrV das regiões Sul e Sudeste do Brasil e a estirpe padrão Shope foram replicadas em células PK-15 e submetidas à nested-PCR para o gene da glicoproteína E. Além desses vírus previamente isolados, foram avaliadas 75 amostras clínicas de cérebro de suíno em um total de 25 animais positivos para a PR no isolamento e na soroneutralização viral e 50 amostras negativas provenientes de animais negativos na soroneutralização viral e de granjas sem histórico de PR. Todas as amostras clínicas tiveram resultados compatíveis com o isolamento e a soroneutralização, e a totalidade das amostras positivas foi classificada como genótipo II. A sensibilidade analítica da nested-PCR foi de 10-1,3 TCID50 mL-1. A combinação da nested-PCR e da restrição enzimática foi capaz de detectar e genotipar o vírus com resultados em um a dois dias, sendo mais rápida que os métodos convencionais de restrição do genoma completo que podem demorar até sete dias.
RESUMO
The occurrence of Mycoplasma spp as contaminant of cell cultures in cell culture laboratories of the Escola de Veterinária da UFMG and of the Laboratório Nacional Agropecuário de Minas Gerais was obtained by the use of a fast DNA extraction protocol e by the use of PCR. The PCR sensitivity and specificity were evaluated. The search for Mycoplasmas DNA was done in 83 cell lines samples. We found infected cell lines in both laboratories. The quality of extracted DNA was verified using a beta-actin gene PCR. The Mycoplasmass PCR showed to be fast, sensitive and specific. KEY WORDS: Beta-actin, cell, culture, Mycoplasma spp, PCR.
A ocorrência de Mycoplasma spp como contaminante de cultivos celulares nos laboratórios de cultivo celular da Escola de Veterinária da UFMG e do Laboratório Nacional Agropecuário de Minas Gerais foi estabelecida através da implementação de um protocolo rápido de extração de DNA e pela utilização da PCR. Avaliaram-se a sensibilidade e especificidade da PCR. Realizou-se pesquisa de DNA de Mycoplasmas em 83 amostras de linhagens celulares e encontraram-se linhagens infectadas nos dois laboratórios avaliados. A qualidade do DNA extraído foi verificada utilizando-se a PCR para o gene da beta-actina. A pesquisa de Mycoplasmas por PCR mostrou-se rápida, sensível e específica.PALAVRAS-CHAVES: Beta-actina, celular, cultivo, Mycoplasma spp, PCR.
RESUMO
The occurrence of Mycoplasma spp as contaminant of cell cultures in cell culture laboratories of the Escola de Veterinária da UFMG and of the Laboratório Nacional Agropecuário de Minas Gerais was obtained by the use of a fast DNA extraction protocol e by the use of PCR. The PCR sensitivity and specificity were evaluated. The search for Mycoplasmas DNA was done in 83 cell lines samples. We found infected cell lines in both laboratories. The quality of extracted DNA was verified using a beta-actin gene PCR. The Mycoplasmass PCR showed to be fast, sensitive and specific. KEY WORDS: Beta-actin, cell, culture, Mycoplasma spp, PCR.
A ocorrência de Mycoplasma spp como contaminante de cultivos celulares nos laboratórios de cultivo celular da Escola de Veterinária da UFMG e do Laboratório Nacional Agropecuário de Minas Gerais foi estabelecida através da implementação de um protocolo rápido de extração de DNA e pela utilização da PCR. Avaliaram-se a sensibilidade e especificidade da PCR. Realizou-se pesquisa de DNA de Mycoplasmas em 83 amostras de linhagens celulares e encontraram-se linhagens infectadas nos dois laboratórios avaliados. A qualidade do DNA extraído foi verificada utilizando-se a PCR para o gene da beta-actina. A pesquisa de Mycoplasmas por PCR mostrou-se rápida, sensível e específica.PALAVRAS-CHAVES: Beta-actina, celular, cultivo, Mycoplasma spp, PCR.