RESUMO

With the aim of a better characterization of the somatic recombination process in Trichoderma pseudokoningii, a progeny from crossings between T. pseudokoningii strains contrasting for auxotroph markers was characterized by RAPD markers and PFGE (electrophoretic karyotype). Cytological studies of the conidia, conidiogenesis and heterokaryotic colonies were also performed. The genotypes of the majority of the recombinant strains analyzed were similar to only one of the parental strains and the low frequency of polymorphic RAPD bands suggested that the nuclear fusions may not occur into the heterokaryon. In some heterokaryotic regions the existence of intensely staining hyphae might be related to cell death. We proposed that a mechanism of somatic recombination other than parasexuality might occur, being related to limited vegetative compatibility after postfusion events, as described for other Trichoderma species.

RESUMO

The Pink Disease is caused by Erythricium salmonicolor, which attacks broad hosts, such as citrus, coffee, rubber, Eucalyptus spp. and Acacia spp., infecting mainly branches. This disease became a serious problem in Brazil, reducing the citrus production up to 10%. However the genetic diversity and compatibility of the fungus E. salmonicolor from Brazilian citrus plants is not yet evaluated. Therefore, the aims of this study were to evaluate: i) the genetic variability of E. salmonicolor in the São Paulo and Minas Gerais States by the RAPD technique, and ii) the vegetative compatibility between these isolates. After RAPD analysis, six distinct groups were observed without correlation between the isolation site or host species. In the vegetative compatibility test, the contact of fungal hyphae between all evaluated crosses was observed, of which 84% presented hyphal fusion. Although the compatibility between strains was observed, no correlation between RAPD haplotypes and hyphal anastomosis was verified. These results show the importance of future studies on the sexual cycle of E. salmonicolor, since hyphal fusion, which precedes the formation of heterokaryons (sexual and parasexual reproduction) that could be responsible for the genetic variability in this species.

A rubelose é uma doença causada pelo fungo Erythricium salmonicolor que atinge muitos hospedeiros, como citros, café, seringueira, eucalipto, Acacia sp., infectando principalmente os galhos. Rubelose é um sério problema para o Brasil, reduzindo a produção de citros em valores próximos de 10%. A diversidade do fungo E. salmonicolor em cultivares brasileiras ainda não foi avaliada. Este trabalho teve como objetivos: i) avaliar a variabilidade genética, por meio de RAPD, de 19 isolados de E. salmonicolor provenientes de diferentes regiões citrícolas de São Paulo e Minas Gerais, ii) avaliar a compatibilidade vegetativa e fusão de hifas do fungo E. salmonicolor. Após a análise por RAPD, foram observados 6 grupos distintos, os quais não apresentaram correlação com o local de origem e espécie hospedeira. No teste de compatibilidade vegetativa, houve encontro de hifas em todos os cruzamentos e 84% destes apresentaram fusão entre elas. Foi verificada compatibilidade entre linhagens, embora não tenha sido observada correlação com os haplótipos. Os resultados observados neste trabalho indicam a importância de futuros estudos sobre a fase sexual do fungo E. salmonicolor, uma vez que a anastomose de hifas precede a formação de heterocário, onde ocorrem os processos de recombinação sexual e parassexual responsáveis pela variabilidade genética em fungos filamentosos.

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The Pink Disease is caused by Erythricium salmonicolor, which attacks broad hosts, such as citrus, coffee, rubber, Eucalyptus spp. and Acacia spp., infecting mainly branches. This disease became a serious problem in Brazil, reducing the citrus production up to 10%. However the genetic diversity and compatibility of the fungus E. salmonicolor from Brazilian citrus plants is not yet evaluated. Therefore, the aims of this study were to evaluate: i) the genetic variability of E. salmonicolor in the São Paulo and Minas Gerais States by the RAPD technique, and ii) the vegetative compatibility between these isolates. After RAPD analysis, six distinct groups were observed without correlation between the isolation site or host species. In the vegetative compatibility test, the contact of fungal hyphae between all evaluated crosses was observed, of which 84% presented hyphal fusion. Although the compatibility between strains was observed, no correlation between RAPD haplotypes and hyphal anastomosis was verified. These results show the importance of future studies on the sexual cycle of E. salmonicolor, since hyphal fusion, which precedes the formation of heterokaryons (sexual and parasexual reproduction) that could be responsible for the genetic variability in this species.

A rubelose é uma doença causada pelo fungo Erythricium salmonicolor que atinge muitos hospedeiros, como citros, café, seringueira, eucalipto, Acacia sp., infectando principalmente os galhos. Rubelose é um sério problema para o Brasil, reduzindo a produção de citros em valores próximos de 10%. A diversidade do fungo E. salmonicolor em cultivares brasileiras ainda não foi avaliada. Este trabalho teve como objetivos: i) avaliar a variabilidade genética, por meio de RAPD, de 19 isolados de E. salmonicolor provenientes de diferentes regiões citrícolas de São Paulo e Minas Gerais, ii) avaliar a compatibilidade vegetativa e fusão de hifas do fungo E. salmonicolor. Após a análise por RAPD, foram observados 6 grupos distintos, os quais não apresentaram correlação com o local de origem e espécie hospedeira. No teste de compatibilidade vegetativa, houve encontro de hifas em todos os cruzamentos e 84% destes apresentaram fusão entre elas. Foi verificada compatibilidade entre linhagens, embora não tenha sido observada correlação com os haplótipos. Os resultados observados neste trabalho indicam a importância de futuros estudos sobre a fase sexual do fungo E. salmonicolor, uma vez que a anastomose de hifas precede a formação de heterocário, onde ocorrem os processos de recombinação sexual e parassexual responsáveis pela variabilidade genética em fungos filamentosos.

RESUMO

The Abnc strain of A. nidulans carries the bncA1 gene (binucleated conidia), which induces the formation of binucleate and trinucleate conidia, displaying a chromosome I duplicated area and shifted to the chromosome II (I->II), and bringing forth genetic instability with degenerated sectors. This work has considered in a cytological level the conidiogenesis of the deteriorated variants isolated from the Abnc strain of A. nidulans, observing the event at the level of structural alterations, which composes the conidiophore, and the variations in the number of sterigmata and conidia nuclei. Cytogenetic analyses of conidiogenesis were accomplished in predetermined periods, under Giemsa stain, to observe the nuclei and analysis through the Scanning Electronic Microscopy, and also the structures that composes the conidiophore. The analyzed, deteriorated variants presented alterations in the cell-foot, metulae and phialides structure, conidiophore number and conidias reduction, and the formation of secondary conidiophores. These alterations can be related to genes for the development, bristle, and activities of NIMA e NINXcdc2 (involved in morphogenesis regulatory cycle) that induce the expression of brislte, establishing the link to the regulation and expression of the genes control throughout the conidiophore development.

A linhagem Abnc de A. nidulans é portadora do gene bncA1 ("binucleated conidia"), que confere a característica de conídios bi e trinucleados, além de apresentar uma região duplicada do cromossomo I e translocada para o cromossomo II (I->II), gerando instabilidade genética com formação de setores deteriorados. Este trabalho analisou citologicamente a conidiogênese dos variantes deteriorados isolados da linhagem Abnc de A. nidulans, observando a ocorrência de alterações das estruturas que compõe o conidióforo e as variações no número de núcleos dos esterígmas e conídios. As análises citogenéticas da conidiogênese foram realizadas com períodos pré-determinados, sendo efetuada a coloração de Giemsa para observação dos núcleos, e análise por Microscopia Eletrônica de Varredura, para observação das estruturas que compõe o conidióforo. Os variantes deteriorados analisados apresentaram alterações na estrutura das células-pé, métulas e fiálides, redução do número de conidióforos e conídios, e formação de conidióforos secundários. Estas alterações no conidióforo podem estar relacionadas com os genes para o desenvolvimento, bristle e com atividade das proteínas NIMA e NINXcdc2 (envolvidas com o ciclo regulatório da morfogênese) as quais induzem a expressão de brislte, estabelecendo o caminho para a regulação e controle da expressão dos genes durante o desenvolvimento do conidióforo.

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The Abnc strain of A. nidulans carries the bncA1 gene (binucleated conidia), which induces the formation of binucleate and trinucleate conidia, displaying a chromosome I duplicated area and shifted to the chromosome II (I->II), and bringing forth genetic instability with degenerated sectors. This work has considered in a cytological level the conidiogenesis of the deteriorated variants isolated from the Abnc strain of A. nidulans, observing the event at the level of structural alterations, which composes the conidiophore, and the variations in the number of sterigmata and conidia nuclei. Cytogenetic analyses of conidiogenesis were accomplished in predetermined periods, under Giemsa stain, to observe the nuclei and analysis through the Scanning Electronic Microscopy, and also the structures that composes the conidiophore. The analyzed, deteriorated variants presented alterations in the cell-foot, metulae and phialides structure, conidiophore number and conidias reduction, and the formation of secondary conidiophores. These alterations can be related to genes for the development, bristle, and activities of NIMA e NINXcdc2 (involved in morphogenesis regulatory cycle) that induce the expression of brislte, establishing the link to the regulation and expression of the genes control throughout the conidiophore development.

A linhagem Abnc de A. nidulans é portadora do gene bncA1 ("binucleated conidia"), que confere a característica de conídios bi e trinucleados, além de apresentar uma região duplicada do cromossomo I e translocada para o cromossomo II (I->II), gerando instabilidade genética com formação de setores deteriorados. Este trabalho analisou citologicamente a conidiogênese dos variantes deteriorados isolados da linhagem Abnc de A. nidulans, observando a ocorrência de alterações das estruturas que compõe o conidióforo e as variações no número de núcleos dos esterígmas e conídios. As análises citogenéticas da conidiogênese foram realizadas com períodos pré-determinados, sendo efetuada a coloração de Giemsa para observação dos núcleos, e análise por Microscopia Eletrônica de Varredura, para observação das estruturas que compõe o conidióforo. Os variantes deteriorados analisados apresentaram alterações na estrutura das células-pé, métulas e fiálides, redução do número de conidióforos e conídios, e formação de conidióforos secundários. Estas alterações no conidióforo podem estar relacionadas com os genes para o desenvolvimento, bristle e com atividade das proteínas NIMA e NINXcdc2 (envolvidas com o ciclo regulatório da morfogênese) as quais induzem a expressão de brislte, estabelecendo o caminho para a regulação e controle da expressão dos genes durante o desenvolvimento do conidióforo.

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Crossing experiments via hyphal anastomosis between two strains contrasting for auxotrophic markers of Trichoderma pseudokoningii were conducted to characterize the somatic recombination process in this specie. Four crossings were made and a total of 1052 colonies obtained from conidial suspensions of the heterokaryotic colonies were analyzed. Sixty-eight recombinant colonies, from four growing generations, were analyzed for the auxotrophic markers. Of the 68 colonies analyzed, 58 were stable after four generations and the remainders were unstable, reverting to one of the parentals. Most of the recombinant colonies were unstable through subculture and after four growing generations they showed the leu ino met markers (auxotrophic for leucin, inositol and metionin respectively). The unstable recombinant colonies showed irregular growing borders, sparse sporulation and frequent sector formation. The results suggest the occurrence of recombination mechanisms in the heterokaryon (somatic recombination), different from those described for the parasexual cycle or parameiosis. Therefore, we proposed the ocurrence of nuclei degradation from one parental (non prevalent parental) in the heterokaryon and that the resulting chromosomal fragments may be incorporated into whole nuclei of the another parental (prevalent parental). However the parameiosis as originally described cannot be excluded.

Com o objetivo de se caracterizar o processo de recombinação somática em Trichoderma pseudokoningii, foram realizados cruzamentos via anastomose de hifas entre duas linhagens desta espécie, contrastantes para os marcadores de auxotrofia. Foram realizados quatro cruzamentos, sendo analisadas um total de 1052 colônias obtidas a partir de suspensões de conídios provenientes das colônias heterocarióticas. Foram analisadas sessenta e oito colônias recombinantes em quatro gerações de crescimento, sendo verificados os marcadores de auxotrofia. Das 68 colônias, 58 se mostraram estáveis após quatro gerações de crescimento e as colônias restantes permaneceram instáveis, revertendo para as marcas de uma das linhagens parentais. A maioria das colônias se mostrou instável através das gerações de subcultivo, e após quatro gerações de crescimento estas apresentaram as marcas de auxotrofia leu ino met (auxotrofia para leucina, inositol e metionina, respectivamente). As colônias recombinantes instáveis apresentaram bordas irregulares de crescimento, esporulação esparsa e a freqüente formação de setores. Os resultados sugerem a ocorrência de mecanismos de recombinação no heterocário (recombinação somática), diferente daqueles descritos para o ciclo parassexual ou parameiose, sendo proposto a ocorrência da degradação no heterocário de núcleos provenientes de uma das linhagens parentais (parental não prevalente) e a incorporação de fragmentos cromossômicos nos núcleos íntegros da outra linhagem parental (parental prevalente). No entanto a parameiose, como originalmente descrita, não pode ser excluída.

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Herpotrichiellaceous fungi, common agents of chromoblastomycosis and phaeohyphomycosis, were searched in samples of rotten wood, leaf littler, bark and soil of the rhizosphere, collected in the Centro Nacional de Pesquisas de Florestas/EMBRAPA, Colombo, PR, Brazil. Morphological analyses of macro, optic and scanning electron microscopy, as well as the determination of the nutritional pattern of the isolated strains were carried out for a taxonomical study. In a total of 17 colonies, 3 isolates (17.6%) were identified as species of medical relevance: Cladophialophora bantiana (Sacc.) de Hoog et al., Fonsecaea pedrosoi (Brumpt) Negroni and Phialophora verrucosa Medlar. The identifications were based on the results of the analyses and on the comparison with CBS (Centraal Bureau voor Schimmelcultures) reference strains. This investigation revealed the saprophytic existence of species known as agents of chromoblastomycosis and phaeohyphomycosis. These diseases are considered autochthonous in the studied area.

Fungos da família Herpotrichiellaceae, agentes comuns de cromoblastomicose e feohifomicose, foram isolados de amostras de solo e de material vegetal em decomposição, durante duas coletas realizadas na propriedade do Centro Nacional de Pesquisa de Florestas/EMBRAPA, localizada em Colombo, PR, Brasil. Após o isolamento, os fungos foram submetidos às análises óticas macro e microscópicas e eletrônica de varredura, além do estudo de seus padrões nutricionais. Das 17 colônias de fungos isoladas, 3 (17,6%) foram identificadas como espécies de importância clínica, tais como: Cladophialophora bantiana (Sacc.) de Hoog et al, Fonsecaea pedrosoi (Brumpt) Negroni e Phialophora verrucosa Medlar. As identificações basearam-se nos resultados dos testes fisiológicos e na comparação da morfologia dos isolados com linhagens referência do CBS (Centraal Bureau voor Schimmelcultures). Esta investigação revelou a existência sapróbia de espécies de fungos conhecidas como agentes de cromoblastomicose e feohifomicose. Tais doenças são tidas como autóctones na região estudada.