RESUMO
Introdução: O Câncer de Pulmão (CP) é uma patologia de grande incidência e mortalidade no Brasil e no mundo. O Instituto Nacional de Câncer (INCA) estimou que em 2020 30.200 mil pacientes teriam CP no país, sendo 17.760 homens e 12.440 mulheres. Em 2019 cerca de 16.733 homens morreram, comparado com 12.631 óbitos em mulheres. Com índices elevados de incidência da doença, notou-se a necessidade de desenvolvimento de métodos não invasivos para o diagnóstico dos pacientes, visando principalmente o conforto destes. Com isto, surge a biópsia líquida, incluindo o escarro, como potencial candidato a alternativa não invasiva de diagnóstico do CP e das mutações drivers. Objetivos: Investigar a presença de DNA tumoral no escarro como uma alternativa de diagnóstico e monitoramento em pacientes com adenocarcinoma pulmonar. Correlacionar os níveis de detecção das mutações nos genes EGFR, KRAS, BRAF e NRAS encontradas no escarro, com resultados de biópsia tecidual (BT) e plasma. Comparar a detecção das mutações ativadoras em escarro, através dos métodos de NGS e ddPCR. Métodos: Foram recrutados pacientes virgens de tratamento, no momento do diagnóstico, após a assinatura do TCLE. Na disponibilidade de escarro de maneira espontânea, as coletas eram realizadas utilizando um frasco contendo uma solução preservante (solução de accomano). Na ausência de produção natural, o paciente era submetido à coleta induzida, utilizando um nebulizador ultrassónico com uma solução salínica hipertônica à 7%. As amostras foram processadas no Biobanco da Instituição, para extração de DNA. Para análise da amostra fgoram utilizadas as técnicas de NGS e ddPCR para identificação da presença das mutações em EGFR, KRAS, BRAF e NRAS em pacientes com CPNPC. Através do método de NGS, 14 genes foram rastreados, com a utilização de um painel customizado. Para a análise de ddPCR, sondas das mutações mais frequentes em EGFR e KRAS (EGFR 858R, EGFR T790M, KRAS G12C e KRAS G12D) foram empregadas. Os dados gerados do escarro em ambos os métodos foram correlacionados com os resultados da BT e do plasma, através da correlação linear e sobrevida pelo método de Kaplan-Meyer. Resultados: Das 42 amostras testadas previamente por biópsia tecidual, 27 possuíam mutação e 15 eram wild type. Entre os 27 casos mutados na BT, 13 foram positivos para mutação driver em escarro através do NGS, sendo 4 em KRAS e 8 em EGFR, tendo uma concordância de 48,15% comparado à BT. De 15 casos wild type no tecido, 3 deles tinham uma mutação no escarro. As maiores VAFs foram encontradas em pacientes com coleta espontânea de escarro, em sua maior parte com estágio IV. Contudo, não houve correlação linear positiva ao comparar os resultados encontrados por NGS no escarro, com os resultados de BT. Com o método de ddPCR, de 17 casos positivos no tecido, zdentificamos 7 mutações no escarro, sendo 4 em EGFR e 3 em KRAS, com uma concordância de 41,17% com o tecido. Comparando os métodos de NGS e ddPCR em escarro, obtivemos uma correspondência de 57,17%. O NGS identificou 6 mutações em 7 casos analisados (85,7%), a ddPCR identificou 5 mutações (71,4%). Obtivemos uma associação linear positiva entre escarro analisado por NGS e escarro analisado por ddPCR (r=0,998 e p=0,0001). Não houve diferença estatisticamente significante entre EC II, III e IV (p=0,959, log rank), e em relação ao regime terapêutico entre pacientes que receberam QT convencional, imunoterapia+QT e terapia alvo (p=0,828, log rank). Na comparação entre pacientes sem mutação, e com mutação em EGFR, não houve diferença significante (p=0,141, log rank), assim como pacientes sem mutação e com mutação em KRAS (p=0,959, log rank). Conclusão: De acordo com os dados apresentados, pudemos verificar que a presença de mutações drivers no escarro detectadas através dos métodos de NGS e ddPCR possui uma boa correlação com o perfil genômico observado nas biópsias teciduais (48.15% e 41,17% respectivamente), especialmente em pacientes com tumores localmente centrais, e com alta carga tumoral. Em relação a comparação entre os métodos, este estudo demonstrou alta sensibilidade e concordância quantitativa de NGS no escarro baseado em amplicons quando comparado com ddPCR para detectar mutações ativadoras em EGFR e KRAS, e a de resistência em EGFR. Por fim, ambos os métodos foram efetivos para este tipo de abordagem específica utilizando ctDNA.
Introduction: Lung cancer (LC) is a pathology of high incidence and mortality in Brazil and worldwide. The National Cancer Institute (INCA) estimated that in 2020 30,200,000 patients would have PC in the country, with 17,760 men and 12,440 women. In 2019 about 16,733 men died, compared to 12,631 deaths in women. With high incidence rates of the disease, it was noted the need for the development of non-invasive methods for the diagnosis of patients, aiming mainly at their comfort. With this, liquid biopsy, including sputum, emerged as a potential candidate for a noninvasive alternative for the diagnosis of LC and driver mutations. Objectives: To investigate the presence of tumor DNA in sputum as a diagnostic and monitoring alternative in patients with lung adenocarcinoma. To correlate the detection levels of mutations in EGFR, KRAS, BRAF and NRAS genes found in sputum, with tissue biopsy (TB) and plasma results. To compare the detection of activating mutations in sputum by NGS and ddPCR methods. Methods: Treatment virgin patients were recruited at the time of diagnosis, after signing the ICF. When spontaneous sputum was available, collections were performed using a vial containing a preservative solution (saccomane solution). In the absence of natural production, the patient underwent induced collection using an ultrasonic nebulizer with a 7% hypertonic saline solution. The samples were processed at the Biobanco of the institution for DNA extraction. For sample analysis, NGS and ddPCR techniques were used to identify the presence of EGFR, KRAS, BRAF and NRAS mutations in patients with NSCLC. Using the NGS method, 14 genes were screened, with the use of a customized panel. For ddPCR analysis, probes of the most frequent mutations in EGFR and KRAS (EGFR L858R, EGFR T790M, KRAS G12C and KRAS G12D) were employed. The generated sputum data in both methods were correlated with TB and plasma results by linear correlation and survival by the KaplanMeyer method. Results: Of the 42 samples previously tested by tissue biopsy, 27 had a mutation and 15 were wild type. Among the 27 mutated cases in TB, 13 were positive for driver mutation in sputum by NGS, being 4 in KRAS and 8 in EGFR, having a concordance of 48.15% compared to TB. Of 15 wild type cases in tissue, 3 of them had a mutation in sputum. The highest VAFs were found in patients with spontaneous sputum collection, mostly with stage IV. However, there was no positive linear correlation when comparing the results found by NGS in sputum, with the TB results. With the ddPCR method, of 17 positive cases in the tissue, we identified 7 mutations in the sputum, 4 in EGFR and 3 in KRAS, with a 41.17% agreement with the tissue. Comparing NGS and ddPCR methods in sputum, we obtained a 57.17% match.NGS identified 6 mutations in 7 cases analyzed (85.7%), ddPCR identified 5 mutations (71.4%). We obtained a positive linear association between sputum analyzed by NGS and sputum analyzed by ddPCR (r=0.998 and p=0.0001). There was no statistically significant difference between CE II, III and IV (p=0.959, log rank), and regarding the therapeutic regimen between patients receiving conventional QT, immunotherapy+QT and targeted therapy (p=0.828, log rank). In the comparison between patients without mutation, and with mutation in EGFR, there was no significant difference (p=0.141, log rank), as well as patients without mutation and with mutation in KRAS (p=0.959, log rank). Conclusion: According to the data presented, we could verify that the presence of driver mutations in sputum detected by NGS and ddPCR methods has a good correlation with the genomic profile observed in tissue biopsies (48.15% and 41.17% respectively), especially in patients with locally central tumors, and with high tumor burden. Regarding the comparison between the methods, this study demonstrated high sensitivity and quantitative agreement of NGS in sputum based amplicons when compared with ddPCR to detect activating mutations in EGFR and KRAS, and that of resistance in EGFR. Finally, both methods were effective for this type of specific approach using ctDNA.