RESUMEN
Salmonella spp. is one of the most common foodborne infectious pathogen. This study aimed to develop a real-time nucleic acid sequence-based amplification (NASBA) assay for detecting Salmonella in foods. Primers and a molecular beacon targeting the Salmonella-specific xcd gene were designed for mRNA transcription, and 48 Salmonella and 18 non-Salmonella strains were examined. The assay showed a high specificity and low detection limit for Salmonella (7 × 10-1 CFU/mL) after 12 h of pre-enrichment. Importantly, it could detect viable cells. Additionally, the efficacy of the NASBA assay was examined in the presence of pork background microbiota; it could detect Salmonella cells at 9.5 × 103 CFU/mL. Lastly, it was successfully used to detect Salmonella in pork, beef, and milk, and its detection limit was as low as 10 CFU/25 g (mL). The real-time NASBA assay developed in this study may be useful for rapid, specific, and sensitive detection of Salmonella in food of animal origin.
Asunto(s)
Carne/microbiología , Leche/microbiología , Salmonella/aislamiento & purificación , Replicación de Secuencia Autosostenida/métodos , Animales , Bovinos , Microbiología de Alimentos , Salmonella/clasificación , Salmonella/genética , PorcinosRESUMEN
CONTEXTO CLÍNICO: Las transfusiones de sangre y hemoderivados constituyen una terapéutica frecuente en la actualidad. Sin embargo, si no se toman las medidas necesarias, quienes reciben las donaciones pueden contraer ciertas enfermedades. Disminuir los riesgos de la transmisión de enfermedades infecciosas es un requisito indispensable para los servicios de medicina transfusional.Para tender a la eliminación de este riesgo, se pueden implementar tres tipos de estrategias: a) tratar los componentes con métodos para inactivación de patógenos, con la finalidad de eliminar agentes infecciosos, b) implementar políticas para la captación del donante no relacionado, habitual y responsable y c) aplicar métodos para detección de infecciones transmisibles con una mayor sensibilidad. En relación a esto último, la detección de marcadores serológicos para infecciones transmisibles por transfusión es muy eficiente y ha reducido de manera importante el impacto de esta complicación transfusional en las últimas décadas.1, 2 Sin embargo, existe un período de ventana, en el cual un donante infectado y potencialmente infectante, no presenta niveles dosables de marcadores serológicos; por este motivo se ha postulado el uso de técnicas que permitan la detección en este período de ventana. Un ejemplo de ellos es la técnica NAT (por sus siglas en inglés: nucleic acid amplification Technology), la cual es una prueba de biología molecular que se ha postulado a nivel mundial desde 1999, para la detección del material genético de los virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), hepatitis C (VHC) y hepatitis B (VHB) con el fin de disminuir el período de ventana de no-detección, en las muestras provenientes de donantes infectados. TECNOLOGÍA: NAT se realiza mediante la realización de los siguientes pasos básicos: la preparación de la muestra, la amplificación de secuencias de ácido nucleico, y la detección de productos de amplificación (amplicons). OBJETIVO: Evaluar la evidencia disponible acerca de la eficacia, seguridad y aspectos relacionados a las políticas de cobertura de la técnica de amplificación de ácido nucleico en forma rutinaria para la detección del virus de la inmunodeficiencia humana, el virus de la hepatitis C y el de la hepatitis B en muestras de sangre de donantes. MÉTODOS: Se realizó una búsqueda en las principales bases de datos bibliográficas (incluyendo Medline, Cochrane y CRD), en buscadores genéricos de Internet, agencias de evaluación de tecnologías sanitarias y financiadores de salud utilizando la siguiente estrategia: (Nucleic Acid Amplification Techniques[Mesh:NoExp] OR Amplification Tech*[tiab] OR Nucleic-Acid Amplificat*[tiab] OR DNA Amplificat*[tiab] OR RNA Amplificat*[tiab] OR NAT[tiab]) AND (Blood Donors[Mesh] OR Blood Don*[tiab] OR Blood Banks[Mesh] OR Blood Bank*[tiab]). Se priorizó la inclusión de revisiones sistemáticas (RS), ensayos clínicos controlados aleatorizados (ECAs), evaluaciones de tecnologías sanitarias y económicas, guías de práctica clínica y políticas de cobertura de otros sistemas de salud cuando estaban disponibles. RESULTADOS: Para el siguiente informe se incluyeron dos estudios observacionales, una revisión no sistemática, cuatro GPC, una ETS, seis normas y dos evaluaciones económicas. CONCLUSIONES: Si bien existe escasa evidencia de moderada calidad metodológica que muestra que la utilización de la técnica de amplificación de ácido nucleico (NAT) es efectiva en la detección de los virus de la inmunodeficiencia humana, hepatitis C y hepatitis B en el período ventana serológico, la magnitud del beneficios de su aplicación en forma rutinaria en muestras de sangre de donantes no ha sido aún aclarada. Si bien el uso de NAT se encuentra muy extendido en el mundo y muchas normativas y guías internacionales lo recomiendan; su implementación no es mandatorio en muchos otros países. La Organización Mundial de la Salud aún no lo recomienda en forma rutinaria para todos los países, sobre todo debido a que se estima que los potenciales beneficios de su aplicación son bajos a expensas de un alto costo. Su uso estaría más justificado en contextos con una mayor prevalencia e incidencia de infecciones transmisibles por la sangre.
Asunto(s)
Humanos , Bancos de Sangre , VIH/aislamiento & purificación , Hepatitis C/sangre , Replicación de Secuencia Autosostenida/métodos , Hepatitis B/sangre , Evaluación de la Tecnología Biomédica , Análisis Costo-Eficiencia , Cobertura de los Servicios de SaludRESUMEN
DNA or RNA amplification methods for detection of Leishmania parasites have advantages regarding sensitivity and potential quantitative characteristics in comparison with conventional diagnostic methods but are often still not routinely applied. However, the use and application of molecular assays are increasing, but comparative studies on the performance of these different assays are lacking. The aim of this study was to compare three molecular assays for detection and quantification of Leishmania parasites in serial dilutions of parasites and in skin biopsies collected from cutaneous leishmaniasis (CL) patients in Manaus, Brazil. A serial dilution of promastigotes spiked in blood was tested in triplicate in three different runs by quantitative nucleic acid sequence-based amplification (QT-NASBA), quantitative real-time reverse transcriptase PCR (qRT-PCR), and quantitative real-time PCR (qPCR). In addition, the costs, durations, and numbers of handling steps were compared, and 84 skin biopsies from patients with suspected CL were tested. Both QT-NASBA and qRT-PCR had a detection limit of 100 parasites/ml of blood, while qPCR detected 1,000 parasites/ml. QT-NASBA had the lowest range of intra-assay variation (coefficients of variation [CV], 0.5% to 3.3%), while qPCR had the lowest range of interassay variation (CV, 0.4% to 5.3%). Furthermore, qRT-PCR had higher r2 values and amplification efficiencies than qPCR, and qPCR and qRT-PCR had faster procedures than QT-NASBA. All assays performed equally well with patient samples, with significant correlations between parasite counts. Overall, qRT-PCR is preferred over QT-NASBA and qPCR as the most optimal diagnostic assay for quantification of Leishmania parasites, since it was highly sensitive and reproducible and the procedure was relatively fast.
Asunto(s)
Leishmania/aislamiento & purificación , Leishmaniasis/diagnóstico , Reacción en Cadena de la Polimerasa/métodos , Reacción en Cadena de la Polimerasa de Transcriptasa Inversa/métodos , Replicación de Secuencia Autosostenida/métodos , Animales , Biopsia , Sangre/parasitología , Brasil , Humanos , Leishmania/genética , Leishmaniasis/parasitología , Leishmaniasis Cutánea/diagnóstico , Leishmaniasis Cutánea/parasitología , Reacción en Cadena de la Polimerasa/economía , Reproducibilidad de los Resultados , Reacción en Cadena de la Polimerasa de Transcriptasa Inversa/economía , Replicación de Secuencia Autosostenida/economía , Sensibilidad y Especificidad , Piel/parasitología , Factores de TiempoRESUMEN
BACKGROUND: Direct detection of HCV RNA by nucleic acid amplification methods is an essential tool in the diagnosis of HCV infections. In-house developed methods based on reverse transcribed polymerase chain reaction (RT-PCR) are widely used but they are laborious and usually lack the standardization required by clinical laboratories. OBJECTIVES: To evaluate the sensitivity and the clinical performance of an HCV specific nucleic acid sequence based amplification (NASBA) assay based on the commercially available, NucliSens Basic Kit (bioMérieux) reagents. STUDY DESIGN: The analytical sensitivity of the Basic Kit-based HCV assay (BK-HCV) was determined using dilutions of the First World Health Organization International Standard for HCV RNA. The performance of the BK-HCV was evaluated at two study sites in comparison with in-house RT-nested PCR (RT-nPCR) by testing a total of 77 plasma specimens. Additional HCV laboratory tests such as Amplicor HCV v2.0 (Roche Diagnostics) and genotype were also included in the comparative analysis. RESULTS: The sensitivity of the BK-HCV was 100-150 IU/ml HCV RNA (85-100% hit rate). When evaluating the clinical performance, we found 96-100% correlation between BK-HCV and RT-nPCR, and 85-91% correlation between BK-HCV and Amplicor. The level of efficiency of the BK-HCV for detecting prevalent HCV genotypes was equal to in house RT-nPCR and Amplicor. CONCLUSIONS: The BK-HCV offers adequate sensitivity for diagnostic purposes and equivalent clinical performance to in-house RT-nPCR assays. The BK-HCV could become a suitable alternative to the in-house amplification methods, providing standardized reagents and procedures, plus rapid results to clinical laboratories.