RESUMEN
La localización intracelular de proteínas involucradas en el control proliferativo puede ser estudiada mediante técnicas de inmunocitoquímica. Con el propósito de establecer la distribución del antígeno tumoral mayor del virus SV40 (agT), proteína p53 (p53) y antígeno nuclear de proliferación celular (PCNA) tanto en el núcleo como en la superficie de células transformadas por el virus SV40 provenientes de una línea de cultivo, se utilizaron técnicas de inmunoperoxidasa tanto a nivel de microscopia de luz y electrónica como técnicas de inmunofluorescencia. Para lograr la optimización de dichas técnicas en nuestro material se evaluaron distintos procedimientos de fijación, dos métodos de permeabilización celular y se efectuaron modificaciones a las técnicas de inmunoperoxidasa e inmunofluorescencia. Los resultados mostraron inmonorreactividad nuclear conservada para los tres antígenos estudiados cuando se utilizaron fijadores alcohólicos. La fijación con aldehídos permitió una buena morfología y óptima inmunorreactividad a nivel de microscopia de luz, pero las células debieron ser sometidas a un tratamiento previo de permeabilización. A nivel de microscopia electrónica se observó pobre morfología con fijadores alcohólicos, la que mejoró notablemente utilizando fijadores a base de aldehídos. Cuando se utilizó glutaraldehídos como fijador no hubo conservación de la inmunorreactividad. El agT de superficie fue demostrado con una técnica de inmunoperoxidasa modificada para ser aplicada a células sin fijar mantenidas en suspensión.
Asunto(s)
Antígenos Virales de Tumores , Inmunohistoquímica , Antígenos Nucleares , Antígenos Virales de Tumores/ultraestructura , Transformación Celular Viral , Técnica del Anticuerpo Fluorescente , Técnicas para Inmunoenzimas , Microscopía Electrónica , Fijación del TejidoRESUMEN
For inorganic crystals such as calcite (CaCO3), Atomic Force Microscopy (AFM) has provided surface structure at atomic resolution (Ohnesorge and Binnig, 1993). As part of a broad effort to obtain high resolution for an individual protein or protein assembly (Binnig et al., 1986; Rugar and Hansma, 1990; Radmacher et al., 1992), we applied AFM to study the ATP-dependent double hexamer of SV40 large T antigen, which assembles around the viral origin of DNA replication. Multimeric mass has been determined in two-dimensional projected images by Scanning Transmission Electron Microscopy (STEM) (Mastrangelo et al., 1989). By AFM, if the DNA-protein preparation has been stained positively by uranyl acetate, the contour at the junction between hexamers is visible as a cleft, 2-4 nm deep. The cleft, whether determined as a fraction of height by AFM or as a fraction of mass thickness by STEM, is of comparable magnitude. On either side of the cleft, hexamers attain a maximum height of 13-16 nm. Monomers found in the absence of ATP show heights of 5-7 nm. Taken together, the z coordinates provide a surface profile of complete and partial replication assemblies consistent with the spatial distribution of recognition pentanucleotides on the DNA, and they contribute direct geometrical evidence for a ring-like hexamer structure.