RESUMEN

Las glicoproteínas de envoltura gp120 y gp41 del VIH-1 son responsables de la interacción con las células CD-4+ y permiten la penetración del virus en éstas, además de otras funciones. El monitoreo del estado infectivo de los cultivos celulares mediante la determinación de gp41 en las células por la técnica de inmunoperoxidasa, es el objetivo final de la normalización de la técnica reportada en nuestro trabajo. Se utilizaron cultivos de celúlas CEM-VIH-1 y células CEM sin infectar como control negativo. La reacción se llevó a cabo mediante el uso de un anticuerpo monoclonal anti-gp41 y se utilizó un conjungado anti IgG de ratón marcado con peroxidasa para revelar la reacción. Los resultados mostraron la posibilidad del uso de esta técnica para el monitoreo de los cultivos celulares utilizados en la producción viral(AU)

Asunto(s)

RESUMEN

Las glicoproteínas de envoltura gp120 y gp41 del VIH-1 son responsables de la interacción con las células CD-4+ y permiten la penetración del virus en éstas, además de otras funciones. El monitoreo del estado infectivo de los cultivos celulares mediante la determinación de gp41 en las células por la técnica de inmunoperoxidasa, es el objetivo final de la normalización de la técnica reportada en nuestro trabajo. Se utilizaron cultivos de celúlas CEM-VIH-1 y células CEM sin infectar como control negativo. La reacción se llevó a cabo mediante el uso de un anticuerpo monoclonal anti-gp41 y se utilizó un conjungado anti IgG de ratón marcado con peroxidasa para revelar la reacción. Los resultados mostraron la posibilidad del uso de esta técnica para el monitoreo de los cultivos celulares utilizados en la producción viral

Asunto(s)

RESUMEN

Se desarrolló un método de Elisa indirecto para el pesquisaje masivo de anticuerpos de ratón contra el virus de la inmunodeficiencia humanos (VIH-1) en sobrenadantes de hibridomas y sueros de animales hiperinmunes. Para la normalización del sistema se evaluaron la concentración de antígeno adsorbida a la fase sólida, la solución tampón diluyente de las muestras, las disoluciones óptimas para cada tipo de muestras y el período de incubación de éstos. Se determinó que una concentración de 5 *g/mL de proteinas virales semipurificadas, una solución tampón de fosfato pH 7,4; 0,1 con tween-20 al 0,05

y albúmina bovina sérica al 1,5

, disoluciones del suero hiperinmune(controles +) y no inmunes (controles -) de 1:2500 y un tiempo de incubación de 18 h a 4-C, ofrecián los mejores resultados. Se obtienen coeficientes de variación interplacas intraplaca por debajo del 5

para los controles positivo/negativo es mayor de 10 en todos los casos

Asunto(s)

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Se desarrolló un método de Elisa indirecto para el pesquisaje masivo de anticuerpos de ratón contra el virus de la inmunodeficiencia humanos (VIH-1) en sobrenadantes de hibridomas y sueros de animales hiperinmunes. Para la normalización del sistema se evaluaron la concentración de antígeno adsorbida a la fase sólida, la solución tampón diluyente de las muestras, las disoluciones óptimas para cada tipo de muestras y el período de incubación de éstos. Se determinó que una concentración de 5 *g/mL de proteinas virales semipurificadas, una solución tampón de fosfato pH 7,4; 0,1 con tween-20 al 0,05% y albúmina bovina sérica al 1,5%, disoluciones del suero hiperinmune(controles +) y no inmunes (controles -) de 1:2500 y un tiempo de incubación de 18 h a 4-C, ofrecián los mejores resultados. Se obtienen coeficientes de variación interplacas intraplaca por debajo del 5% para los controles positivo/negativo es mayor de 10 en todos los casos

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Se utilizó el sistema conservatorio de detección de anticuerpos al VIH-1 "DAVIH-blot", basado en la inmunoelectrotransferencia y desarrollado en nuestros laboratorios como sistema de confirmación para sueros humanos, como sistema de referencia para normalizar una variante adecuada para el estudio de sueros de ratones hiperinmunes, líquidos ascíticos y sobrenadante de cultivo de hibridomas de ratón. Se compararon las siguientes variaciones de la etapa inmunológica: soluciones amortiguadoras para la dilución de las muestras y conjugados, soluciones bloqueadoras, temperatura y tiempo de incubación, y se determinaron las condiciones experimentales óptimas: usar como solución amortiguadora para la dilución de las muestras y conjugados, una solución de Tris-0,02M-NaCl0,5 con Tween-20 al 0,05

(TNT), no usar solucion bloqueadora antes de la adición del conjugado e incubar el antisuero conjugado 1 hora a 37 -C

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RESUMEN

Se utilizó el sistema conservatorio de detección de anticuerpos al VIH-1 "DAVIH-blot", basado en la inmunoelectrotransferencia y desarrollado en nuestros laboratorios como sistema de confirmación para sueros humanos, como sistema de referencia para normalizar una variante adecuada para el estudio de sueros de ratones hiperinmunes, líquidos ascíticos y sobrenadante de cultivo de hibridomas de ratón. Se compararon las siguientes variaciones de la etapa inmunológica: soluciones amortiguadoras para la dilución de las muestras y conjugados, soluciones bloqueadoras, temperatura y tiempo de incubación, y se determinaron las condiciones experimentales óptimas: usar como solución amortiguadora para la dilución de las muestras y conjugados, una solución de Tris-0,02M-NaCl0,5 con Tween-20 al 0,05 %(TNT), no usar solucion bloqueadora antes de la adición del conjugado e incubar el antisuero conjugado 1 hora a 37 -C

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Se describe una técnica de ELISA que permite el pesquizaje masivo y rápido de sobrenadantes de cultivos de hibridomas secretores de anticuerpos monoclonales. Se preparan microplacas de 96 pocillos (poliestireno) recubiertos con solución que contiene 5 *g/mL de antisuero de conejo antiinmunoglobulinas de ratón, que se emplean como soporte. Se utilizan 150 *L de una dilución 1:5 de cada muestra en estudio y como segundo anticuerpo se emplea un antisuero de carnero antiinmunoglobulinas de ratón conjugado con peroxidasa. La peroxidasa enlazada se cuantifica mediante el uso de un sistema peroxidasa-H2 O2-dihidrocloruro de 0-fenilendiamina y lectura en el espectrofotómetro vertical a 492 nm. Como controles positivos se incluyen diluciones de suero normal de ratón y anticuerpos monoclonales purificados (OKT11) y como controles negativos, sobrenadantes de cultivos de células no secretoras de inmunoglobulinas. La técnica permite la detección de inmunoglobulinas de ratón en concentraciones entre 5 y 175 *g/mL

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