RESUMEN

In the present work, the polymerase chain reaction (PCR) assay and his variants RT-PCR and Multiplex PCR were applied for the detection of specific sequences of Enterovirus, Human Herpes viruses (Herpes simple virus, Human Herpes virus type 6, Cytomegalovirus, Epstein Barr virus, and Varicella Zoster), Human Immunodeficiency virus, Toxoplasma gondii, Mycobacterium tuberculosis and Mycoplasma pneumoniae in patients' cohorts grouped by medical suspicion of meningoencephalitis. Of 326 samples of processed cerebrospinal fluid (CSF), 93 samples (28.5%) were positive for the different infectious agents. In the group of patients with clinical diagnosis of viral meningoencephalitis (n=212), there was obtained a whole of 73 positive samples (34.4%), of which 37 patients were positive to Enterovirus (50.7%), 19 were positive to VHS (26%) and 10 patients (13.7%) were positive to CMV. Other viral agents as VZV, EBV and HVH6 were detected in minor frequency. The 114 remaining samples were analyzed applying specific PCR to each pathogen for strict medical indication, being able to detect the presence of Human Immunodeficiency Virus (40%), Mycoplasma pneumoniae (40%), Toxoplasma gondii (14%) and Mycobacterium tuberculosis (12%) in CSF samples. The results obtained in this study demonstrate the convenience of the application of the molecular assays in the laboratory diagnosis of the meningoencefalitis of different etiology. Besides this, it is also a very valuable tool for the clinical management of the patients and for the execution of the epidemiological studies.

Asunto(s)

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En el presente trabajo se aplicó el ensayo de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) y sus variantes RT-PCR y Multiplex PCR para la detección de secuencias específicas de Enterovirus, Herpesvirus humanos (Virus Herpes simple y Virus Herpes tipo 6, Citomegalovirus, Epstein Barr, Varicela Zoster), Virus de Inmunodeficiencia Humana, Toxoplasma gondii, Micobacterium tuberculosis y Micoplasma pneumoniae en muestras de liquido cefalorraquídeo (LCR) de cohortes de pacientes con sospecha clínica de meningoencefalitis. De las 322 muestras de LCR procesadas, se detectaron un total de 93 muestras positivas (28,8 por ciento) para los distintos agentes infecciosos. En el grupo de pacientes con diagnóstico clínico de meningoencefalitis viral (n=212), se obtuvo un total de 73 muestras positivas (34,4 por ciento), de las cuales 37 fueron positivas a Enterovirus (50,7 por ciento), 19 a VHS (26 por ciento) y 10 pacientes (13,7 por ciento) fueron positivos a CMV. Los otros agentes virales VZV, EBV y HVH6 se encontraron en menor frecuencia. Las 110 muestras restantes de LCR se analizaron aplicando PCR específicos a cada patógeno por estricta indicación médica, pudiéndose detectar en ellas la presencia de Virus de lnmunodeficiencia Humana (40 por ciento), Micoplasma pneumoniae (40 por ciento), Toxoplasma gondii (14 por ciento) y Micobacterium tuberculosis (12 por ciento). Los resultados obtenidos en este estudio demuestran la conveniencia de la aplicación de las técnicas moleculares en el diagnóstico de laboratorio de las meningoencefalitis de diferente etiología, siendo además una herramienta muy valiosa para el manejo clínico de los pacientes y para la ejecución de estudios epidemiológicos

Asunto(s)

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Se describe la normalización de un ultramicroELISA para la detección de anticuerpos IgG anti-antígenos de excreción-secreción de Fasciola hepatica (UME-Fasciola). Se estudió un numeroso grupo de sueros entre los cuales 56 eran de pacientes con fascioliasis, 168 eran de pacientes con otras enfermedades parasitarias y 300 procedían de personas sanas, las cuales fueron utilizadas como controles negativos. Respecto al examen parasitológico considerado como "Regla de Oro", el UME-Fasciola mostró una sensibilidad del 100 por ciento, especificidad de 98 por ciento y valores predictivos para positivos y negativos de 90,3 y 100 por ciento, respectivamente. Sólo se observó reacción cruzada con los sueros de pacientes infectados con Opistorchis felineus. Al comparar el UME-Fasciola con el ELISA convencional se obtuvo un índice de concordancia de 95,5 por ciento(AU)

Asunto(s)

RESUMEN

Se reportan los resultados obtenidos en el estudio de un brote de fiebre y rash ocurrido en Ciudad de La Habana en marzo de 1995. En las muestras de 35 pacientes se descartaron dengue, sarampión, rubéola, herpes simple y Epstein Barr como agentes causales del brote. Mediante la detección de anticuerpos IgM y la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (RCP) se identificó al Parvovirus B19 como agente causal del brote. En 14/18 muestras (77,7 por ciento) se comprobó la infección por este agente por alguna de las técnicas empleadas. Este estudio se refiere al primer brote confirmado de Parvovirus B19 en Cuba(AU)

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Se reportan los resultados obtenidos en el estudio de un brote de fiebre y rash ocurrido en Ciudad de La Habana en marzo de 1995. En las muestras de 35 pacientes se descartaron dengue, sarampión, rubéola, herpes simple y Epstein Barr como agentes causales del brote. Mediante la detección de anticuerpos IgM y la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (RCP) se identificó al Parvovirus B19 como agente causal del brote. En 14/18 muestras (77,7 por ciento) se comprobó la infección por este agente por alguna de las técnicas empleadas. Este estudio se refiere al primer brote confirmado de Parvovirus B19 en Cuba

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Se describe la normalización de un ultramicroELISA para la detección de anticuerpos IgG anti-antígenos de excreción-secreción de Fasciola hepatica (UME-Fasciola). Se estudió un numeroso grupo de sueros entre los cuales 56 eran de pacientes con fascioliasis, 168 eran de pacientes con otras enfermedades parasitarias y 300 procedían de personas sanas, las cuales fueron utilizadas como controles negativos. Respecto al examen parasitológico considerado como "Regla de Oro", el UME-Fasciola mostró una sensibilidad del 100 por ciento, especificidad de 98 por ciento y valores predictivos para positivos y negativos de 90,3 y 100 por ciento, respectivamente. Sólo se observó reacción cruzada con los sueros de pacientes infectados con Opistorchis felineus. Al comparar el UME-Fasciola con el ELISA convencional se obtuvo un índice de concordancia de 95,5 por ciento

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Se normalizó un ensayo de ultramicroELISA de doble anticuerpo para la detección de anticuerpos IgG al virus sincitial respiratorio (VSR), para ello se dispuso de un anticuerpo monoclonal antiproteína F del VSR, producido por el Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología de La Habana (CIGB). La utilización de este anticuerpo posibilitó la inclusión de preparaciones antigénicas crudas en lugar de fracciones purificadas, lo que disminuye notablemente la reactividad obtenida con el control de antígeno. Las condiciones del ensayo fueron determinadas mediante titulación cruzada y se obtuvo una sensibilidad de 97,2 por ciento, un 91 por ciento de coincidencia y una especificidad 83,3 por ciento del UMELISA con respecto a la fijación del complemento. Los resultados pueden ser expresados cualitativamente o en títulos de anticuerpos empleando una sola dilución de suero (1:40) y una curva patrón(AU)

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Se normalizó un ensayo de ultramicroELISA de doble anticuerpo para la detección de anticuerpos IgG al virus sincitial respiratorio (VSR), para ello se dispuso de un anticuerpo monoclonal antiproteína F del VSR, producido por el Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología de La Habana (CIGB). La utilización de este anticuerpo posibilitó la inclusión de preparaciones antigénicas crudas en lugar de fracciones purificadas, lo que disminuye notablemente la reactividad obtenida con el control de antígeno. Las condiciones del ensayo fueron determinadas mediante titulación cruzada y se obtuvo una sensibilidad de 97,2 %, un 91 % de coincidencia y una especificidad 83,3 % del UMELISA con respecto a la fijación del complemento. Los resultados pueden ser expresados cualitativamente o en títulos de anticuerpos empleando una sola dilución de suero (1:40) y una curva patrón.

An ultramicroELISA assay of double antibody for the detection of IgG antibodies to the respiratory syncytial virus (RSV) wasstandardized. It was used a RVS antiprotein F monoclonal antibody produced by the Genetic Engineering and Biotechnology Center (GEBC) in Havana. The use of this antibody allowed to include crude antigenic preparations instead of purified fractions, which caused a significant reduction of the reactivity obtained with the antigen control. The assay conditions were determined by crossed titration. It was obtained a sensitivity of 97.2 %, a coincidence of 91 %, and a specificity of 83.3 % of the UMELISA as regards the complement fixation. The results may be qualitatively expressed or by antibody titres using only one serum dillution (1:40) and a pattern curve.

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Utilizando como referencia la cepa 44/93 aislada durante la epidemia de neuropatía en Cuba en 1991 y caracterizada como productora en cultivo celular de efecto citopático ligero (ECP-L), se logró la normalización de un ELISA para la identificación rápida de otras cepas con similar efecto. El ensayo consistió en un ELISA tipo sandwich donde las condiciones seleccionadas para cada reactivo (10 µg/mL para el anticuerpo de recubrimiento, 1 mg/mL para el antígeno y dilución 1/2 000 para el conjugado) permitieron una adecuada discriminación entre el antígeno y el control de antígeno para la cepa de referencia empleada. La evolución de un papel de cepas virales de referencia y de otras cepas productoras de ECP-L, mostró un 100 por ciento de coincidencia entre este método y el aislamiento en cultivo celular. Los resultados obtenidos nos permiten recomendar la utilización de este ensayo como una alternativa más precisa en la identificación de estos agentes(AU)

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Se logró normalizar un procedimiento que combinaba un ensayo de ultramicroELISA indirecto con una curva patrón y que permitió estimar el título de anticuerpos IgG a Adenovirus en muestras de suero humano utilizando una sola dilución de éstos. Basándose en el título a punto final previamente determinado para un panel de 117 muestras de suero, se seleccionaron 90 de éstas (r2 = 0,98) para construir 4 curvas patrones que relacionaron el logaritmo natural de las respuestas de fluorescencia y el logaritmo natural del título a punto final para un rango amplio de diluciones del suero (1:40 hasta 1:320). Se seleccionó la curva correspondiente a la dilución 1:40 del suero (r2 = 0,81), la cual posibilitó una óptima utilización de los accesorios diseñados para la manipulación de los volúmenes en el rango ultramicro y, por tanto, la automatización de todo el procedimiento. Los resultados obtenidos con respecto a la técnica de fijación del complemento (100 por ciento de sensibilidad y 97,3 por ciento de especificidad) respaldan la utilización de este método como una herramienta complementaria en la ejecución de estudios seroepidemiológicos a gran escala y con fines diagnósticos (AU)

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Se logro normalizar un procedimiento que combinaba un ensayo de ultramicroELISA indirecto con una curva patron y que permitio estimar el titulo de anticuerpos IgG a Adenovirus en muestras de suero humano utilizando una sola dilucion de estos. Basandose en el titulo a punto final previamente determinado para un panel de 117 muestras de suero, se seleccionaron 90 de estas (r2 = 0,98) para construir 4 curvas patrones que relacionaron el logaritmo natural de las respuestas de fluorescencia y el logaritmo natural del titulo a punto final para un rango amplio de diluciones del suero (1:40 hasta 1:320). Se selecciono la curva correspondiente a la dilucion 1:40 del suero (r2 = 0,81), la cual posibilito una optima utilizacion de los accesorios disenados para la manipulacion de los volumenes en el rango ultramicro y, por tanto, la automatizacion de todo el procedimiento. Los resultados obtenidos con respecto a la tecnica de fijacion del complemento (100 por ciento de sensibilidad y 97,3 por ciento de especificidad) respaldan la utilizacion de este metodo como una herramienta complementaria en la ejecucion de estudios seroepidemiologicos a gran escala y con fines diagnosticos

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Utilizando como referencia la cepa 44/93 aislada durante la epidemia de neuropatia en Cuba en 1991 y caracterizada como productora en cultivo celular de efecto citopatico ligero (ECP-L), se logro la normalizacion de un ELISA para la identificacion rapida de otras cepas con similar efecto. El ensayo consistio en un ELISA tipo sandwich donde las condiciones seleccionadas para cada reactivo (10 g/mL para el anticuerpo de recubrimiento, 1 mg/mL para el antigeno y dilucion 1/2 000 para el conjugado) permitieron una adecuada discriminacion entre el antigeno y el control de antigeno para la cepa de referencia empleada. La evolucion de un papel de cepas virales de referencia y de otras cepas productoras de ECP-L, mostro un 100 por ciento de coincidencia entre este metodo y el aislamiento en cultivo celular. Los resultados obtenidos nos permiten recomendar la utilizacion de este ensayo como una alternativa mas precisa en la identificacion de estos agentes

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Se presentan los resultados del estudio de validación del ensayo ultramicroanalítico de detección de anticuerpos contra el antígeno de superficie de la hepatitis B (UMELISA anti HBsAg), que se realizó comparando los resultados obtenidos, con el juego diagnóstico comercial Hepanostika anti-HBsAg. Se utilizaron para ello sueros procedentes de los ensayos clínicos de la vacuna recombinante cubana contra la hepatitis B. Con el primer panel de sueros (n = 300) se obtuvo el 93,1 por ciento de sensibilidad, el 98,5 por ciento de especificidad y una concordancia del 94,3 por ciento. El coeficiente de correlación indicó una tendencia similar de los resultados (p < 0,01) y no se encontraron diferencias significativas en el título promedio geométrico (TPG) entre ambos ensayos (P > 0,05). Con el segundo panel (n = 100), realizado en el Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí" (IPK) y el Centro de Inmunoensayo (CIE) simulatáneamente, se obtuvo una sensibilidad del 96,25 por ciento en ambos centros, una especificidad del 75 por ciento en el IPK y del 90 por ciento en el CIE y una coincidencia del 92 y 95 por ciento, respectivamente. El coeficiente de correlación mostró valores similares y no hubo diferencias significativas entre las TPG alcanzadas por los 2 métodos (P > 0,05). Los resultados obtenidos en general muestran la validez del nuevo ensayo y la factibilidad de su utilización en la práctica, ya sea para el seguimiento de la infección o para la realización de ensayos clínicos de evaluación de vacunas(AU)

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Se presentan los resultados del estudio de validacion del ensayo ultramicroanalitico de deteccion de anticuerpos contra el antigeno de superficie de la hepatitis B (UMELISA anti HBsAg), que se realizo comparando los resultados obtenidos, con el juego diagnostico comercial Hepanostika anti-HBsAg. Se utilizaron para ello sueros procedentes de los ensayos clinicos de la vacuna recombinante cubana contra la hepatitis B. Con el primer panel de sueros (n = 300) se obtuvo el 93,1 por ciento de sensibilidad, el 98,5 por ciento de especificidad y una concordancia del 94,3 por ciento. El coeficiente de correlacion indico una tendencia similar de los resultados (p < 0,01) y no se encontraron diferencias significativas en el titulo promedio geometrico (TPG) entre ambos ensayos (P > 0,05). Con el segundo panel (n = 100), realizado en el Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kouri" (IPK) y el Centro de Inmunoensayo (CIE) simulataneamente, se obtuvo una sensibilidad del 96,25 por ciento en ambos centros, una especificidad del 75 por ciento en el IPK y del 90 por ciento en el CIE y una coincidencia del 92 y 95 por ciento, respectivamente. El coeficiente de correlacion mostro valores similares y no hubo diferencias significativas entre las TPG alcanzadas por los 2 metodos (P > 0,05). Los resultados obtenidos en general muestran la validez del nuevo ensayo y la factibilidad de su utilizacion en la practica, ya sea para el seguimiento de la infeccion o para la realizacion de ensayos clinicos de evaluacion de vacunas

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Durante 1993, nuestro país se vio afectado por un brote de neuropatía epidémica (NE) caracterizado por 2 formas clínicas fundamentales: óptica y periférica. Aunque la causa de la enfermedad fue considerada multifactorial (fundamentalmente agentes neurotóxicos y deficiencia nutricional), fue aislado un Enterovirus del líquido cefalorraquídeo de un paciente (cepa 47/93, IPK), el cual fue posteriormente clasificado como Coxsackie A9 (Cox A9) mediante la prueba de neutralización (Nt) utilizando los pools de suero de Lim Benyesh Melnick (LBM). Se presentan los resultados obtenidos durante la aplicación del ELISA y del ultramicroELISA en la identificación de este agente a partir del sobrenadante de cultivo de células infectadas, así como en la detección de anticuerpos a la cepa en poblaciones con baja y alta incidencias de la enfermedad (AU)

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Durante 1993, nuestro pais se vio afectado por un brote de neuropatia epidemica (NE) caracterizado por 2 formas clinicas fundamentales: optica y periferica. Aunque la causa de la enfermedad fue considerada multifactorial (fundamentalmente agentes neurotoxicos y deficiencia nutricional), fue aislado un Enterovirus del liquido cefalorraquideo de un paciente (cepa 47/93, IPK), el cual fue posteriormente clasificado como Coxsackie A9 (Cox A9) mediante la prueba de neutralizacion (Nt) utilizando los pools de suero de Lim Benyesh Melnick (LBM). Se presentan los resultados obtenidos durante la aplicacion del ELISA y del ultramicroELISA en la identificacion de este agente a partir del sobrenadante de cultivo de celulas infectadas, asi como en la deteccion de anticuerpos a la cepa en poblaciones con baja y alta incidencias de la enfermedad

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We have standardized an indirect ultramicro ELISA assay for detecting antibodies to human Cytomegalovirus (CMV) using human serum samples (UMELISA CMV). The optimal concentration of coating antigen (30 ug/ml), serum dilution (1:40) and anti-human conjugate working dilution (1:1500), were determined by a check board titration method. The UMELISA CMV was compared with the latex agglutination test for antibodies to CMV (Dupont de Nemours) and with an indirect immunofluorescent method. The results have showed the high coincidence, sensitivity and especificity of the proposed assay regarding the two methods compared with, and supporting its use either for a blood donors screening or in the serological diagnosis of this infection by paired serum samples.

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La disponibilidad del sistema Ultramicroanalitico (SUMA) y de un antigeno especie-especifico del M. leprae obtenido mediante sintesis quimica, permitio la normalizacion y validacion de un ultramicroELISA para la deteccion de anticuerpos IgM especificos a esta micobacteria. El analisis de 433 sueros de banco de sangue y 265 sueros usados para validar el metodo y clasificados en un grupo control de donantes de banco de sangre (100), un grupo de pacientes tuberculosos (50), un grupo de enfermos de lepra (65) y un grupo de contactos de estos enfermos (50), mostro la especificidad del ensayo para evidenciar la infeccion con el M. leprae. Los resultados obtenidos del estudio adicional de 140 muestras de suero de contactos de enfermos estuvieron estrechamente correlacionados (r = 0,98) con los resultados obtenidos por la tecnica de microELISA convencional. La utilizacion del SUMA no solo permite un notable ahorro de reactivos si no ademas facilita la lectura, calculo, validacion y almacenamiento automatico de los resultados.

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