RESUMEN
The mammalian target of rapamycin complex 1 (mTORC1) is a critical regulator of protein synthesis. The best studied targets of mTORC1 in translation are the eukaryotic initiation factor-binding protein 1 (4E-BP1) and ribosomal protein S6 kinase 1 (S6K1). In this study, we identify the La-related protein 1 (LARP1) as a key novel target of mTORC1 with a fundamental role in terminal oligopyrimidine (TOP) mRNA translation. Recent genome-wide studies indicate that TOP and TOP-like mRNAs compose a large portion of the mTORC1 translatome, but the mechanism by which mTORC1 controls TOP mRNA translation is incompletely understood. Here, we report that LARP1 functions as a key repressor of TOP mRNA translation downstream of mTORC1. Our data show the following: (i) LARP1 associates with mTORC1 via RAPTOR; (ii) LARP1 interacts with TOP mRNAs in an mTORC1-dependent manner; (iii) LARP1 binds the 5'TOP motif to repress TOP mRNA translation; and (iv) LARP1 competes with the eukaryotic initiation factor (eIF) 4G for TOP mRNA binding. Importantly, from a drug resistance standpoint, our data also show that reducing LARP1 protein levels by RNA interference attenuates the inhibitory effect of rapamycin, Torin1, and amino acid deprivation on TOP mRNA translation. Collectively, our findings demonstrate that LARP1 functions as an important repressor of TOP mRNA translation downstream of mTORC1.
Asunto(s)
Autoantígenos/metabolismo , Regulación hacia Abajo , Glicoproteínas de Membrana/metabolismo , Biosíntesis de Proteínas , ARN Mensajero/genética , Ribonucleoproteínas/metabolismo , Proteínas Adaptadoras Transductoras de Señales/genética , Proteínas Adaptadoras Transductoras de Señales/metabolismo , Autoantígenos/genética , Factor 4E Eucariótico de Iniciación/genética , Factor 4E Eucariótico de Iniciación/metabolismo , Humanos , Diana Mecanicista del Complejo 1 de la Rapamicina , Glicoproteínas de Membrana/genética , Complejos Multiproteicos/genética , Complejos Multiproteicos/metabolismo , Unión Proteica , ARN Largo no Codificante , ARN Mensajero/química , ARN Mensajero/metabolismo , Proteína Reguladora Asociada a mTOR , Ribonucleoproteínas/genética , Serina-Treonina Quinasas TOR/genética , Serina-Treonina Quinasas TOR/metabolismo , Antígeno SS-BRESUMEN
La obtención de leche a partir de ratones de laboratorio (Mus musculus) podría ser interesante para una gran variedad de estudios preclínicos. Son muy escasas las referencias en la literatura científica sobre protocolos que describan como obtener estas muestras, siendo la principal limitación de tales protocolos el pequeño volumen de muestra que es habitual obtener. El objetivo de nuestro estudio fue desarrollar un método funcional para obtener fácilmente cantidades considerables de leche de ratón. Hembras adultas de la variedad no consanguíneas NMRI y de la consanguínea BALB/c con su camada fueron utilizadas en este estudio. La leche fue recogida entre los días 7-12 tras el parto. Las crías fueron separadas de sus madres entre 6-12 horas antes del ordeño para permitir la acumulación de leche en las glándulas. Las hembras fueron anestesiadas usando o una mezcla de midazolam y ketamina, o empleando isoflurano como agente inhalatorio. Para inducir la eyección de la leche, se administro una dosis de 2-8 UI de oxitocina intraperitonealmente. La leche fue recogida usando un sacaleches eléctrico para humanos que fue modificado para adaptarse al pezón de los ratones y para recoger pequeños volúmenes. Con este procedimiento, la cantidad de leche obtenida de los ratones osciló entre los 0,2 y los 1,5 ml. Concluimos por tanto, que este método proporciona una excelente manera de adquirir cantidades considerables de leche de ratón (AU)
Collecting milk samples from mice (Mus musculus) may be interesting for a variety of preclinical research. References in the literature for protocols describing how to milk a dam are scarce, and a major limitation of such protocols is the small sample volume that is generally collected. The aim of our study was to develop a practical protocol to collect substantial amounts of milk from mice. Adult female outbred NMRI and inbred BALB/c mice with nursing litters were used in this study. The milking was carried out on days 712 after parturition. The pups were separated from their mothers for 612 h before milking to allow accumulation of milk in the glands. Dams were anesthetized using either an injectable mixture of midazolam and ketamine, or by use of the inhalational agent isoflurane. To induce milk flow, the mice were given 2-8 IU of oxytocin intraperitoneally. The milk was collected using an electric human breast pump that was modified to accommodate mouse nipples and to handle small liquid volumes. With this protocol, the total amount of milk collected from each dam per each milking ranged between 0.2 and 1.5 mL. We concluded that this milking method provides an excellent means for acquiring substantial amounts of mouse milk (AU)