RESUMEN
Peptides corresponding to sequences derived from predicted extra- and intracellular loops of the rat bradykinin receptor were analyzed for interspecies homology as well as for matches within the present dataset of protein sequences to provide a theoretical basis for the specific recognition of the native cognate protein by antibodies raised against these antigens. Application of polyclonal antibodies raised against the selected peptides allowed the immunocytochemical localization of the native receptor protein in cells of rat and human origin. The detection of the molecule was achieved by different immunohisto- and immunocytochemical methods in combination with light, fluorescence, confocal optical laser and electron microscopy. These results were compared to localization studies by autoradiography. Distribution and subcellular localization were determined in human neutrophils, human epithelial carcinoma cells (A431) and in rat kidney tissue.
Asunto(s)
Cininas/fisiología , Receptores de Bradiquinina/metabolismo , Secuencia de Aminoácidos , Animales , Autorradiografía , Sitios de Unión de Anticuerpos , Células Cultivadas , Técnicas de Cultivo , Técnica del Anticuerpo Fluorescente , Humanos , Técnicas para Inmunoenzimas , Riñón/metabolismo , Datos de Secuencia Molecular , Neutrófilos/metabolismo , Ratas , Ratas Sprague-Dawley , Receptor de Bradiquinina B2 , Homología de Secuencia , Especificidad de la Especie , Células Tumorales CultivadasRESUMEN
Peptides corresponding to sequences derived from predicted extra- and intracellular loops of the rat bradykinin receptor were analyzed for interspecies homology as well as for matches within the present dataset of protein sequences to provide a theoretical basis for the specific recognition of the native cognate protein by antibodies raised against these antigens. Apllication of polyclonal antibodies raised against the selected peptides allowed the immunocytochemical localization of the native receptor protein in cells of rat and human origin. The detection of the molecule was achieved by different immunohisto- and immunocytochemical methods in combination with light, fluorescence, confocal optical laser and electron microscopy. These results were compared to localization studies by autoradiography. Distribution and subcellular localization were determined in human neutrophils, human epithelial carcinoma cells (A431) and in rat kidney tissue
Asunto(s)
Ratas , Humanos , Animales , Cininas/fisiología , Neutrófilos/metabolismo , Receptores de Bradiquinina/metabolismo , Secuencia de Aminoácidos , Autorradiografía , Sitios de Unión de Anticuerpos , Células Cultivadas , Técnicas de Cultivo , Especificidad de la Especie , Técnica del Anticuerpo Fluorescente , Técnicas para Inmunoenzimas , Riñón/metabolismo , Homología de Secuencia , Células Tumorales CultivadasRESUMEN
En la Tercera Fase del estudio de la IFCC para la estandarización de la medición de apolipoproteína apo A-I fue investigada la preparación de SP1-01, seleccionada como candidata a material de referencia internacional para apo A-I, según su capacidad para transferir un valor basado en la exactitud a los calibradores de los inmunoensayos, y en producir comparabilidad de los valores en muestras de pacientes. Se asignó un valor de apo A-I de 1,50 g/L al SP1-01, mediante un radioinmunoensayo estandarizado, calibrado con apo A-I purificada, con un valor de masa determinado por análisis de aminoácidos. De acuerdo a un detallado protocolo en común, los participantes transfirieron el valor de masa del SP1-01 al calibrador de cada método. Cada laboratorio analizó 50 muestras de sueros frescos congelados, de individuos donantes, siguiendo un procedimiento similar al adoptado por el Cholesterol Reference Laboratory Network para confirmar que la uniformidad de la calibración asegura la comparabilidad de los valores sobre un amplio rango de valores de apo A-I. El valor medio consensuado sobre cada muestra estuvo en excelente concordancia con el valor asignado por el Northwest Lipid Research Laboratories, con la desviación absoluta promedio entre el valor asignado y el consensuado de 0.01 g/L. El CV interlaboratorios sobre cada una de las 50 muestras tuvo rangos entre 2.1%y 5.6%con un CV%promedio de 3.6%, demostrando que pueden obtenerse resultados de apo A-I comparables por una variedad de métodos inmunoquímicos, mediante el uso de materiales de referencia certificados. Sobre la base de los resultados obtenidos en estos estudios, el SP1-01 ha sido aprobado como material de referencia internacional por la Organización Mundial de la Salud
Asunto(s)
Estudio Comparativo , Humanos , Estándares de Referencia , Apolipoproteínas A/análisis , Apolipoproteínas B/análisis , Técnicas de Laboratorio Clínico/normas , Ensayos Clínicos como Asunto/métodos , Estudio de Evaluación , Análisis de Regresión , Apolipoproteínas A/sangre , Apolipoproteínas B/sangre , Técnicas de Laboratorio Clínico/instrumentación , Técnicas de Laboratorio Clínico/métodos , Análisis Químico de la Sangre/normas , Calibración/normas , Recolección de Muestras de Sangre/métodosRESUMEN
En la Tercera Fase del estudio de la IFCC para la estandarización de la medición de apolipoproteína apo A-I fue investigada la preparación de SP1-01, seleccionada como candidata a material de referencia internacional para apo A-I, según su capacidad para transferir un valor basado en la exactitud a los calibradores de los inmunoensayos, y en producir comparabilidad de los valores en muestras de pacientes. Se asignó un valor de apo A-I de 1,50 g/L al SP1-01, mediante un radioinmunoensayo estandarizado, calibrado con apo A-I purificada, con un valor de masa determinado por análisis de aminoácidos. De acuerdo a un detallado protocolo en común, los participantes transfirieron el valor de masa del SP1-01 al calibrador de cada método. Cada laboratorio analizó 50 muestras de sueros frescos congelados, de individuos donantes, siguiendo un procedimiento similar al adoptado por el Cholesterol Reference Laboratory Network para confirmar que la uniformidad de la calibración asegura la comparabilidad de los valores sobre un amplio rango de valores de apo A-I. El valor medio consensuado sobre cada muestra estuvo en excelente concordancia con el valor asignado por el Northwest Lipid Research Laboratories, con la desviación absoluta promedio entre el valor asignado y el consensuado de 0.01 g/L. El CV interlaboratorios sobre cada una de las 50 muestras tuvo rangos entre 2.1%y 5.6%con un CV%promedio de 3.6%, demostrando que pueden obtenerse resultados de apo A-I comparables por una variedad de métodos inmunoquímicos, mediante el uso de materiales de referencia certificados. Sobre la base de los resultados obtenidos en estos estudios, el SP1-01 ha sido aprobado como material de referencia internacional por la Organización Mundial de la Salud
Asunto(s)
Humanos , Apolipoproteínas A/análisis , Apolipoproteínas B/análisis , Técnicas de Laboratorio Clínico/normas , Ensayos Clínicos como Asunto , Estudio de Evaluación , Estándares de Referencia , Análisis de Regresión , Análisis Químico de la Sangre/normas , Apolipoproteínas A/sangre , Apolipoproteínas B/sangre , Calibración/normas , Técnicas de Laboratorio Clínico , Técnicas de Laboratorio Clínico/instrumentación , Recolección de Muestras de Sangre/métodosRESUMEN
An immunocytochemical study was performed to examine the cellular localization and the subcellular distribution of kininogens in human blood cells. Kininogens were visualised using the immunogold-silver staining method and confocal scanning laser microscopy. We confirmed the existence of high molecular weight kininogen in human neutrophils and describe for the first time the presence of low molecular weight kininogen on these cells. Both high and low molecular weight kininogens were restricted to the neutrophils where they localized as clusters of immunogold particles on the cell membrane. No labeling was observed intracellularly in organelles such as mitochondria, endoplasmic reticulum, and azurophilic or specific granules after permeabilization of the neutrophils with Triton X-100, a procedure that permitted the visualization of elastase in the azurophilic granules. Clusters of high molecular weight kininogen molecules attached to the neutrophil surface could serve as receptors for plasma kallikrein and/or be the source of substrate for a discrete and circumscribed formation of kinins that may in turn facilitate the local diapedesis of neutrophils and the transudation of plasma constituents during acute inflammation.